楊雪亮，劉小靜，韓 銘，劉順愛(ài)，成 軍，藺淑梅

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 100020)

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)、生活方式及生活習(xí)慣均發(fā)生明顯的改變， 脂肪性肝病的發(fā)病率在我國(guó)逐年上升，嚴(yán)重威脅人民的健康。代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolism-associated fatty liver disease, MAFLD)是最常見(jiàn)的一種脂肪性肝病，普通成人MAFLD患病率高達(dá)15%～30%，現(xiàn)在MAFLD已取代乙型肝炎，成為我國(guó)的第一大慢性肝病[1]。目前由于MAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，故尚無(wú)特異性治療MAFLD的藥物。因此，深入探討MAFLD發(fā)生的分子機(jī)制，尤其肝細(xì)胞中三酰甘油合成的分子機(jī)制，對(duì)治療MAFLD具有重要意義。

三酰甘油的攝入、生成、分解的異常均能引起MAFLD。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory-element-binding protein, SREBP)是一種結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活膽固醇和三酰甘油生物合成相關(guān)酶的表達(dá)[2]。SREBP有3種異構(gòu)體：SREBP1c、SREBP1a、SREBP2[3]，其中SREBP1c促進(jìn)肝內(nèi)三酰甘油生成[4]。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)與乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC1)是促進(jìn)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，是三酰甘油生成中不可缺少的酶。SREBP1c通過(guò)上調(diào)FASN、ACC1表達(dá)，促進(jìn)三酰甘油生成[5]。HCV結(jié)合蛋白6(hepatitis C binding protein 6, HCBP6)是本課題組通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種HCV核心蛋白結(jié)合蛋白[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，HCBP6能夠結(jié)合在SREBP1c啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)促進(jìn)SREBP1c基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)SREBP1c-FASN 信號(hào)通路表達(dá)，促進(jìn)三酰甘油生成[7]。

通過(guò)改變代謝酶的表達(dá)水平、控制底物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)或產(chǎn)物的濃度、進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾均能促進(jìn)機(jī)體的代謝，其中蛋白磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾手段[8]。蛋白磷酸化位點(diǎn)通常在絲氨酸和蘇氨酸。HCBP6是一種富含絲氨酸的蛋白。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HCBP6的第10位、第151位絲氨酸(Ser-10、Ser-151)可能存在磷酸化。本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)，模擬Ser-10、Ser-151磷酸化與去磷酸化，探討HCBP6模擬磷酸化對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及引物HepG2細(xì)胞、pcDNA3.1/myc-his(-)質(zhì)粒、pGL4.10-basic質(zhì)粒、pcDNA3.1-HCBP6質(zhì)粒為北京地壇醫(yī)院傳染病研究所保存。快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自北京全式金公司。總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司。SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，M-PERTM Mammalian Protein Extraction Reagent購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Cocktail of Protease Inhibitors購(gòu)自美國(guó)Roche公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Pierce?ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，HCBP6兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，SREBP1c兔單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司，F(xiàn)ASN兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，ACC1兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Phospho-ACC1兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，GAPDH兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，三酰甘油檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，油紅O購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自法國(guó)Polyplus公司。

實(shí)驗(yàn)中所有引物均由蘇州泓迅公司(北京)合成，所有的引物序列見(jiàn)表1所示，其中以β-actin作為qRT-PCR的內(nèi)參，qRT-PCR的產(chǎn)物的計(jì)算采用相對(duì)定量法，即2-ΔΔCT法。qRT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 HCBP6第10位與第151位絲氨酸模擬磷酸化與去磷酸化HCBP6第10位、第151位是絲氨酸，采用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)可能存在磷酸化，通過(guò)點(diǎn)突變，將絲氨酸突變?yōu)楸彼幔沟肏CBP6持續(xù)去磷酸化；將絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，使得HCBP6持續(xù)磷酸化。其中HCBP6不同類型質(zhì)粒如下所述：HCBP6野生型質(zhì)粒p-HCBP6；HCBP6第10位氨基酸去磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 10Ala(p-10Ala)；HCBP6第10位氨基酸磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 10Asp(p-10Asp)；HCBP6第151位氨基酸去磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 151Ala(p-151Ala)；HCBP6第151位氨基酸磷酸化質(zhì)粒p-HCBP6 151Asp(p-151Asp)。以野生型pcDNA3.1-HCBP6質(zhì)粒為模板，采用Primer X數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)，利用快速點(diǎn)突變?cè)噭┖?，通過(guò)PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物消化、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒提取，成功構(gòu)建HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化質(zhì)粒。

1.3 細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量的測(cè)定復(fù)蘇的肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，采用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞傳至3～4代，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞飽滿時(shí)，將HepG2細(xì)胞鋪在6孔板，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。采用三酰甘油檢測(cè)試劑盒測(cè)定三酰甘油含量。

1.4 油紅O染色取6孔板，每孔放1塊爬片，將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞鋪板并進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。40 g/L的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，配好的油紅工作液室溫染色30 min，600 mL/L的異丙醇快速清洗細(xì)胞，用PBS輕輕清洗細(xì)胞2次，顯微鏡下觀察染色的情況。再用配好的蘇木素染液進(jìn)行細(xì)胞核染色5 min，用PBS反復(fù)清洗細(xì)胞，至顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴，其中三酰甘油染成紅色。

1.5 qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)將HepG2細(xì)胞鋪在12孔板或者6孔板，采用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h，收獲12孔板的細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)SREBP1c、ACC1及FASN mRNA的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染48 h，收獲6孔板的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，然后蛋白變性后進(jìn)行凝膠電泳、電轉(zhuǎn)印、抗體孵育并曝光，檢測(cè)SREBP1c、ACC1及FASN蛋白的表達(dá)情況。

1.6 啟動(dòng)子活性檢測(cè)將HepG2細(xì)胞鋪在48孔板，將成功構(gòu)建的SREBP1c核心啟動(dòng)子P2螢光素酶報(bào)告基因載體及HCBP6不同類型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染24 h后，采用雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒進(jìn)行報(bào)告基因的活性檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 HCBP6 Ser-10磷酸化促進(jìn)三酰甘油生成圖1顯示，轉(zhuǎn)染p-10Asp的HepG2細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平高于轉(zhuǎn)染p-10Ala(P=0.001)或p-HCBP6(P=0.005)，而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油水平無(wú)明顯區(qū)別(P=0.062)，且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6；圖2顯示，轉(zhuǎn)染p-10Asp的HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂滴多于轉(zhuǎn)染p-10Ala或p-HCBP6，而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6，且二者細(xì)胞內(nèi)蓄積的脂質(zhì)無(wú)明顯區(qū)別，說(shuō)明HCBP6 Ser-10磷酸化促進(jìn)三酰甘油生成。

圖1 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平的影響

圖2 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成的影響

2.2 HCBP6 Ser-10磷酸化能增強(qiáng)SREBP1c-FASN信號(hào)通路表達(dá)圖3A顯示，在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后，HepG2細(xì)胞SREBP1c的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala上升約46%(P<0.001)，較p-HCBP6組表達(dá)水平上升約96%(P<0.001)，而轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的SREBP1c的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P=0.675)，且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6；圖3B結(jié)果顯示，在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后，HepG2細(xì)胞的FASN的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala僅上升11%，但較p-HCBP6組表達(dá)水平上升69%(P=0.01)，而轉(zhuǎn)染p-151Asp較轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的FASN的mRNA表達(dá)水平上升約3倍(P=0.002)，但是較p-HCBP6表達(dá)水平無(wú)明顯上升(P=0.428)；圖3C結(jié)果顯示，在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后，HepG2細(xì)胞的ACC1的mRNA表達(dá)水平較p-10Ala與p-HCBP6組均未見(jiàn)明顯增加(P=0.947，P=0.108)，且轉(zhuǎn)染p-151Asp與轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的ACC1的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P=0.213)，且二者均低于轉(zhuǎn)染p-HCBP6。綜上所述，HCBP6 Ser-10磷酸化，促進(jìn)SREBP1c、FASN的mRNA表達(dá)，而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c、FASN的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。

圖3 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c-FASN-ACC1 mRNA的影響

如圖4所示，轉(zhuǎn)染p-10Asp的SREBP1c、p-ACC1、FASN的蛋白表達(dá)均較轉(zhuǎn)染p-10Ala顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)染p-151Asp的SREBP1c的蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染p-151Ala減少，轉(zhuǎn)染p-151Asp的FASN的蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染p-151Ala增加，轉(zhuǎn)染p-151Asp與p-151Ala的p-ACC1的蛋白表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別。綜上所述，HCBP6 Ser-10磷酸化，促進(jìn)SREBP1c、ACC1、FASN的蛋白表達(dá)，而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c、ACC1、FASN的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

圖4 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c-FASN-ACC1的蛋白的影響

2.3 HCBP6 Ser-10磷酸化后可能富集于SREBP1c啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)SREBP1c轉(zhuǎn)錄翻譯圖5結(jié)果顯示，在p-10Asp轉(zhuǎn)染24 h后，HepG2細(xì)胞的SREBP1c核心啟動(dòng)子P2相對(duì)活性較p-10Ala上升約57%(P=0.003)，較p-HCBP6組上升約44%(P=0.004)，而轉(zhuǎn)染p-151Asp較轉(zhuǎn)染p-151Ala的HepG2細(xì)胞的啟動(dòng)子P2相對(duì)活性無(wú)明顯變化(P=0.104)。綜上所述，HCBP6 Ser-10磷酸化，增強(qiáng)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性，而HCBP6 Ser-151磷酸化對(duì)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性無(wú)明顯影響。

圖5 HCBP6不同位點(diǎn)磷酸化對(duì)SREBP1c核心啟動(dòng)子P2活性的影響

p-ACC1是磷酸化的ACC1，GAPDH作為分子內(nèi)參。p-NC為空質(zhì)粒；p-HCBP6為野生型HCBP6質(zhì)粒；p-10Ala為 HCBP6第10位去磷酸化質(zhì)粒；p-10Asp為HCBP6第10位磷酸化質(zhì)粒；p-151Ala為HCBP6第151位去磷酸化質(zhì)粒；p-151Asp為HCBP6第151位磷酸化質(zhì)粒。

3 討 論

HCBP6是本課題組通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選到的與丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白結(jié)合的一種新蛋白[9]。早期將眾多的可以與HCV核心蛋白結(jié)合的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)很多的已知蛋白基因，如載脂蛋白A1(APO-A1)、載脂蛋白A2(APO-A2)等[10]。根據(jù)以上研究結(jié)果，HCV感染與肝臟脂肪變的研究開(kāi)始受到重視，為HCV感染引起肝臟脂肪變性提供許多證據(jù)，發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎與肝臟脂肪變密切相關(guān)[11-12]。研究證實(shí)，HCV 核心蛋白在丙型肝炎病毒引起的脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[13-14]。HCBP6作為其中的一種HCV核心蛋白結(jié)合的蛋白，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HCBP6可能調(diào)控與肝細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增生、分化及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等密切相關(guān)的基因[15]。這高度提示HCBP6作為HCV核心蛋白的結(jié)合蛋白可能在脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制或脂質(zhì)代謝中起重要作用。通過(guò)分子、細(xì)胞及動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn)，HCBP6對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇和三酰甘油代謝均具有調(diào)節(jié)作用[7,16-17]。

蛋白磷酸化是最常見(jiàn)、最重要的一種翻譯后修飾，參與并調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生命活動(dòng)。既往研究發(fā)現(xiàn)，參與三酰甘油合成與代謝的蛋白通過(guò)不同位點(diǎn)磷酸化發(fā)揮調(diào)控作用。如早期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪三酰甘油脂酶(adipose triglyceride lipase, ATCL)是一種磷酸化的蛋白酶，分別在Ser-406與Ser-430存在磷酸化位點(diǎn)[18]，其中AMPK促使Ser-406磷酸化，從而激活A(yù)TGL酶，促進(jìn)三酰甘油水解[19]。ACC1是脂肪酸合成與代謝中重要的中間產(chǎn)物，其中Ser-66、Ser-79、Ser-117分別存在磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素與酪氨酸激酶共同作用，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的ACC1 Ser-66磷酸化[20]，AMPK促進(jìn)ACC1 Ser-79磷酸化[21]，而PKA促進(jìn)Ser-117磷酸化[22]，降低ACC1活性。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HCBP6可能也是一種磷酸化蛋白，其中的Ser10、Ser151可能存在磷酸化。

蛋白磷酸化位點(diǎn)通常在絲氨酸和蘇氨酸，將這些氨基酸利用定點(diǎn)誘變的方式突變?yōu)楸彼岷蟪掷m(xù)去磷酸化，這是因?yàn)楸彼崾欠菢O性氨基酸，永遠(yuǎn)都不會(huì)發(fā)生磷酸化，而將絲氨酸或者蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼峄蛘咛於彼岷髮⒊掷m(xù)磷酸化，這是因?yàn)楣劝彼崤c天冬氨酸是帶有羧基側(cè)鏈，本身具有負(fù)電荷的極性氨基酸，這與蛋白磷酸化非常類似，因此一定程度上模擬了磷酸化所產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng)，一定程度上激活底物，是一種模擬磷酸化狀態(tài)的技術(shù)手段。早在1993年，MORRISON等[23]將表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的Thr-654與Thr-669定點(diǎn)突變?yōu)镚lu-654與Glu-669模擬EGFR磷酸化，研究EGFR的Thr-654與Thr-66磷酸化受到PKC與MAPK調(diào)控。2005年YANAGAWA等[24]將磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI的Ser-185定點(diǎn)突變?yōu)镚lu-185、Asp-185、Ala-185，證實(shí)PGI通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)酶活性。2018年JOOS等[25]發(fā)現(xiàn)組蛋白H3 Ser28定點(diǎn)突變?yōu)锳la-28模擬H3去磷酸化，顯示H3去磷酸化后能延長(zhǎng)壽命、提高抗饑餓能力、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。說(shuō)明利用定點(diǎn)突變技術(shù)，模擬蛋白磷酸化是一項(xiàng)得到長(zhǎng)久和廣泛應(yīng)用的技術(shù)，是一種被認(rèn)可的蛋白修飾技術(shù)。

本研究通過(guò)該手段模擬HCBP6的Ser-10、Ser-151磷酸化與去磷酸化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HCBP6 Ser-10磷酸化后增強(qiáng)SREBP1c-FASN信號(hào)通路表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油生成；抑制HCBP6磷酸化，減少肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油生成。這可能是未來(lái)治療MAFLD的分子靶點(diǎn)。