蓋敏濤，劉 芬，陳小翠，陳邦黨

（新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊 830011）

動(dòng)脈血管壁上纖維脂質(zhì)斑塊的形成引起動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），并導(dǎo)致心梗等心血管疾病發(fā)生，是導(dǎo)致疾病死亡的主要原因之一[1]。載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein e gene knock out,ApoE-/-）小鼠可以在動(dòng)脈血管自發(fā)形成AS斑塊，是良好的AS模型，其廣泛應(yīng)用在AS疾病研究中[2]。由于小鼠的頸動(dòng)脈血管非常細(xì)小，既往的普通超聲系統(tǒng)很難識(shí)別和檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈的AS特點(diǎn)。因此基礎(chǔ)研究常通過(guò)處死小鼠以獲取組織進(jìn)行病理檢測(cè)來(lái)觀察小鼠AS進(jìn)展特點(diǎn)，但AS小鼠模型通常需要4個(gè)月以上的建模時(shí)間。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的超聲生物顯微鏡（ul?trasound biomicroscopy,UBM）開(kāi)始應(yīng)用在小型動(dòng)物中，能實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)小型嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)血管斑塊，其能夠通過(guò)檢測(cè)主動(dòng)脈根部以及主動(dòng)脈升部血管以檢測(cè)AS[3-4]。臨床上常通過(guò)檢測(cè)左頸總動(dòng)脈的內(nèi)-中膜厚度(Intima-media thickness,IMT)來(lái)反應(yīng)頸動(dòng)脈AS以及預(yù)測(cè)潛在心血管事件的發(fā)生[5]。通過(guò)檢測(cè)頸總動(dòng)脈相關(guān)指標(biāo)可以預(yù)測(cè)斑塊破裂[6]。中國(guó)中老年人群頸總動(dòng)脈AS有36.2%伴隨有IMT、斑塊以及狹窄程度增加[7]。本研究通過(guò)UBM方法檢查ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈血管與AS特點(diǎn)相關(guān)的指標(biāo)，并與病理檢測(cè)結(jié)果比較，從而探討UBM方法能否作為檢查ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈血管AS進(jìn)展的有效檢測(cè)方法，并尋找評(píng)價(jià)小鼠AS進(jìn)展特點(diǎn)的可靠指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)使用8周齡ApoE-/-雄性小鼠15只，采用自身前后對(duì)照設(shè)計(jì)，所有小鼠從北京維通利華公司購(gòu)置（小鼠生產(chǎn)和使用合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001）。動(dòng)物在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。動(dòng)物使用遵守新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法，符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.1.2 主要儀器 本實(shí)驗(yàn)使用Vevo3100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(富士VisualSonics,多倫多,加拿大)進(jìn)行檢測(cè)，配備40MHZ的電子線陣超聲探頭（型號(hào)MX550D）。麻醉系統(tǒng)使用Matrx VMR小動(dòng)物麻醉機(jī)（MIDMARK，美國(guó)）。冰凍切片機(jī)使用CM1950冰凍切片機(jī)（萊卡，德國(guó)）。圖像采集使用DM3000圖像采集系統(tǒng)（萊卡，德國(guó)）。

1.2 ApoE-/-小鼠AS模型的復(fù)制小鼠AS模型建立按照前期方法建立[8]，即通過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，用含21%脂肪和0.25%膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 檢查方法

1.3.1 UBM超聲檢查方法 使用異氟烷麻醉機(jī)誘導(dǎo)（濃度2.50%）和維持（濃度1.50%）小鼠麻醉，小鼠固定在監(jiān)測(cè)臺(tái)，全程體溫維持在36.5℃左右，心率維持在300～400次/min。頸部區(qū)域進(jìn)行脫毛處理，充分暴露皮膚，調(diào)整操作臺(tái)使小鼠左側(cè)向上5°，檢測(cè)最大深度為1.5 cm，檢測(cè)聚焦在0.7 cm深度。先找到左頸總動(dòng)脈縱軸血管，檢測(cè)位置離左頸總內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處1～3 mm處，將探頭旋轉(zhuǎn)90°，在短軸檢測(cè)其IMT以及狹窄程度，IMT的測(cè)量方法參照人血管IMT的測(cè)量方法[9]，SI圖像獲取通過(guò)留取動(dòng)態(tài)圖像。將檢測(cè)的IMT、SI的B-mode動(dòng)態(tài)圖片導(dǎo)入vevolab軟件系統(tǒng)中，使用血管分析設(shè)置進(jìn)行測(cè)量分析，在血管舒張期末截取靜態(tài)圖像。通過(guò)將vevolab軟件中獲取的圖像導(dǎo)入ImageJ 1.46r軟件，獲取血管內(nèi)膜面積及血管腔面積進(jìn)行分析。

1.3.2 組織取材、處理與包埋 小鼠處死后，打開(kāi)胸腔，充分暴露主動(dòng)脈血管，分離完整主動(dòng)脈。將剝離的主動(dòng)脈置入4%多聚甲醛固定12 h后，使用PBS清洗，將主動(dòng)脈分叉處的左頸總動(dòng)脈血管從分叉根部至遠(yuǎn)端1 cm進(jìn)行裁剪后，使用OCT包埋劑包埋于包埋座上，注意組織從上到下垂直包埋并置于干冰上。包埋劑充分凝固后，將包埋塊在冰凍切片機(jī)內(nèi)-20℃條件下，進(jìn)行切片，切片厚度6 um，切下組織粘附在氨基酸防脫載玻片上，每個(gè)樣本留取5張切片，-20℃保存待用。

1.3.3 HE染色方法 切好的片子復(fù)溫后置入蒸餾水中2 min，隨后蘇木素染液染色2～5 min,水洗，0.5%鹽酸酒精分色片刻，PBS中返藍(lán)，0.5%伊紅染液染色1～2 min，清水洗2 min，隨后使用酒精逐級(jí)脫水，滴加中性樹(shù)膠封片。

1.3.4 油紅O染色 染色方法參考文獻(xiàn)[8]，斑塊面積%=斑塊面積×100%/管壁總面積[10]，左頸總動(dòng)脈血管油紅O染色，具體步驟同上，最終使用水性封片劑封片。

1.3.5 染色切片IMT及SI的測(cè)量 使用ImageJ 1.46r軟件測(cè)量HE染色獲取的左頸總動(dòng)脈血管橫斷面圖像，分別分析IMT及SI；SI測(cè)量通過(guò)分別圈取血管內(nèi)膜、血管腔，測(cè)量其面積，然后計(jì)算SI，計(jì)算公式為[（血管內(nèi)膜面積－腔面積）/血管內(nèi)膜面積][11]。

1.3.6 小鼠血脂檢測(cè)將收集的全血進(jìn)行血漿分離后，使用AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司）檢測(cè)血清總膽固醇。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行，所有資料均為計(jì)量資料，通過(guò)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)單因素方差分析和SNK方法進(jìn)行檢驗(yàn)。兩樣本相關(guān)性分析通過(guò)Pear son相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠AS模型的特點(diǎn)在第24周處死小鼠，看到小鼠主動(dòng)脈弓部和左頸總動(dòng)脈有白色斑塊樣組織附著（圖1 A）。主動(dòng)脈油紅O大體染色可見(jiàn)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)斑塊形成，經(jīng)檢測(cè)斑塊面積為（21.80±2.33）%，并且在頸總動(dòng)脈可以看到紅色的斑塊（圖1 B、C）?？偰懝檀己繛?14.85±1.70)mmol/L，達(dá)到一般AS小鼠血脂指標(biāo)范圍。以上油紅O染色及血脂結(jié)果表明AS模型復(fù)制成功。

圖1 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的主動(dòng)脈血管解剖圖像和油紅O染色結(jié)果

2.2 UBM檢查AS小鼠不同時(shí)間點(diǎn)左頸總動(dòng)脈血管的變化UBM檢查結(jié)果顯示，左頸總動(dòng)脈的IMT和SI指標(biāo)隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)。在第16周、第20周和第24周的IMT檢測(cè)結(jié)果分別為(0.11±0.01)mm、(0.14±0.01)mm、(0.15±0.01)mm，并且第20周和第24周的IMT結(jié)果較第16周均有顯著增加(P=0.010和P=0.002)（圖2 A）。在第16周、第20周和第24周的SI結(jié)果分別為(61±11)%、(73±8)%、(77±4)%，第20周、第24周與第16周比較均有顯著增加(P=0.006和P=0.005)。見(jiàn)圖2B。

2.3 UBM檢測(cè)結(jié)果與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果UBM檢查獲得的左頸總動(dòng)脈圖像表明在第16、第20和第24周，隨著AS模型時(shí)間的延長(zhǎng)，左頸總動(dòng)脈血管的管壁逐漸增厚，血管管腔逐漸狹窄（圖3）。在第24周的油紅O染色及HE染色檢測(cè)結(jié)果也顯示左頸總動(dòng)脈的血管壁增厚，管壁有斑塊，管腔有狹窄（圖4）。

圖2 UBM檢查左頸總動(dòng)脈血管IMT和SI的變化趨勢(shì)

圖3 UBM檢查不同時(shí)間點(diǎn)的左頸總動(dòng)脈橫軸圖像

圖4 正常小鼠和AS小鼠模型第24周左頸總動(dòng)脈的油紅O染色及HE染色結(jié)果

2.4 UBM檢查與病理檢查結(jié)果的比較和相關(guān)性分析在第24周的UMB檢查的IMT結(jié)果與病理學(xué)HE染色檢測(cè)的IMT結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.15±0.01)mmvs(0.18±0.04)mm,P＞0.05]。UMB檢查的SI結(jié)果與病理學(xué)HE染色檢測(cè)的SI結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義[(53±12)%vs(77±4)%,P=0.017]。見(jiàn) 圖5 A、B。兩種檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)（r=0.80，P=0.016）。見(jiàn)圖5 C。

圖5 第24周UBM檢查結(jié)果與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果的比較與相關(guān)性分析

3 討論

已有研究顯示，使用UBM檢測(cè)到的ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的升主動(dòng)脈的IMT為0.12～0.25 mm，血漿TC值在10～20 mmol/L[12]，AS小鼠模型頸總動(dòng)脈的狹窄程度為（0.72±0.15）%[13]，主動(dòng)脈大體油紅O染色的斑塊面積為(29.8±3.2)%[8]，均與本研究檢測(cè)結(jié)果接近。提示本研究中的AS模型成功，且檢測(cè)的主要結(jié)果與其它研究相接近，但由于檢測(cè)部位和時(shí)間上的不同，存在小的差異。本研究結(jié)果表明，UBM檢查小鼠左頸總動(dòng)脈的IMT指標(biāo)是反映小鼠左頸總動(dòng)脈AS的進(jìn)展趨勢(shì)的良好指標(biāo)。說(shuō)明UBM檢查ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈可以作為一種無(wú)創(chuàng)性的檢查方法評(píng)價(jià)AS進(jìn)展。

UBM目前被用于在體微小結(jié)構(gòu)檢測(cè)，包括眼睛病變，小鼠心臟血流，以及血管形態(tài)和斑塊等檢測(cè)中[14-16]。Zhang等[3]使用UBM檢測(cè)LDL-R基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部的IMT，其UBM的檢測(cè)結(jié)果與病理結(jié)果一致。Liu等[12]研究顯示血漿中miR-217水平與UBM檢查的升主動(dòng)脈的IMT水平相關(guān)。本研究通過(guò)UBM檢測(cè)ApoE-/-小鼠的左頸總動(dòng)脈IMT，發(fā)現(xiàn)其與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果也一致且呈正相關(guān)，說(shuō)明UBM在檢測(cè)主動(dòng)脈血管的IMT是一個(gè)可靠的檢測(cè)方法，能夠反映AS的進(jìn)展程度。

頸動(dòng)脈狹窄增加了心血管疾病和腦中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。Jung等[17]研究顯示，頸動(dòng)脈狹窄與人體外周血管疾病相關(guān)，使用超聲檢測(cè)人體頸動(dòng)脈狹窄程度是一種篩選外周血管疾病伴隨多級(jí)病變和心血管疾病的有效的手段。Haberka等[18]研究顯示，頸總動(dòng)脈狹窄程度和IMT等指標(biāo)可以預(yù)測(cè)高危心血管疾病病人血運(yùn)重建風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)模擬人體檢測(cè)方法，檢測(cè)ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈的狹窄情況，表明其管腔隨著模型建立時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸縮窄，能夠顯示AS形成的趨勢(shì)，但其與病理檢測(cè)結(jié)果存在不一致?？赡苁遣±頇z測(cè)的固定血管狀態(tài)和UBM超聲檢測(cè)的血管在體收縮運(yùn)動(dòng)的血管狀態(tài)存在差異，也可能是本研究中UBM超聲檢測(cè)SI的方法還不夠完善。以上研究說(shuō)明超聲檢測(cè)AS的SI指標(biāo)可以表現(xiàn)其AS進(jìn)展趨勢(shì)，但與病理學(xué)檢查的官腔狹窄情況存在差異。

本研究還存在一些不足之處，首先，在使用UBM進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的檢查的同時(shí)，病理學(xué)檢測(cè)僅在第24周檢測(cè)，如果在不同時(shí)間點(diǎn)也進(jìn)行病理學(xué)的檢測(cè)，研究結(jié)果將更加完善；其次，本研究的血脂結(jié)果僅有總膽固醇的數(shù)據(jù)，缺少其它血脂水平數(shù)據(jù)。

綜上所述，UBM檢查ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈IMT指標(biāo)與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，能夠較好的表示AS模型進(jìn)展。UBM檢查ApoE-/-小鼠左頸總動(dòng)脈SI指標(biāo)能較好地表示AS進(jìn)展趨勢(shì)。UBM成像作為一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈血管粥樣硬化的病變進(jìn)展程度。