王 寧，娜迪拉，李秋菊，尹明月

（新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院干保中心綜合內(nèi)二科，2第七附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，烏魯木齊 830054）

血管病變與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，其中大血管疾病成為糖尿病的首要死亡原因。高血糖、胰島素抵抗及與其相關(guān)的炎癥、氧化應(yīng)激等均與血管病變、特別是血管內(nèi)皮功能異常密切相關(guān)。PPIA對應(yīng)的蛋白質(zhì)為親環(huán)蛋白A(cyclophilin A,Cy?PA)，CyPA是近年廣受關(guān)注的與血管疾病相關(guān)的蛋白，近期研究顯示，CyPA/CD147信號通路與多種心血管疾病以及糖尿病密切相關(guān)[1-2]，目前認(rèn)為的機(jī)制包括CyPA參與血管壁炎癥反應(yīng)，而且與血管壁氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，CyPA同時(shí)還是一類新型RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）。而CyPA是否作為RBP對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響仍不明確，特別是對長鏈非編碼RNA（lncRNA）表達(dá)的影響，有待研究。

1 材料與方法

1.1 材料采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)（Scien?cell公司）為研究對象進(jìn)行試驗(yàn)。使用試劑：ECM（Sciencell公司）、胎牛血清（Gibco公司）、0.25%胰酶（Gibco公司）、DMSO（MP公司）。晶芯?生物芯片ln?cRNA通用標(biāo)記試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞復(fù)蘇置入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃，5%CO2飽和濕度條件下，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。進(jìn)行細(xì)胞分組，分為過表達(dá)3個(gè)組（實(shí)驗(yàn)組）、對照組3個(gè)組。對照組繼續(xù)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行PPIA過表達(dá)轉(zhuǎn)染。

1.2.2 采用慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)PPIA的過表達(dá)采用慢病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建NC病毒（病毒滴度1.35×109TU/mL）和包含PPIA的病毒（病毒滴度2.23×109TU/mL）。轉(zhuǎn)染后鑒定感染空載病毒的細(xì)胞樣品MOI為18，感染PPIA病毒的細(xì)胞樣品MOI為18。

1.2.3 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）對差異表達(dá)lncRNAs進(jìn)行驗(yàn)證 按Trizol試劑說明書提供的方法提取總RNA，測量RNA濃度及檢測RNA質(zhì)量，保證適宜濃度及A260/A280在1.8～2.0。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行定量擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate de?hydrogenase,GAPDH)作為對照基因，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。采用2-ΔΔCt法將每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的濃度歸一化至GAPDH mRNA水平。所有樣品的循環(huán)閾值（cycle?threshold，Ct)都根據(jù)以內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算樣品的相對表達(dá)量。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt（對照組）。（PPIA：上游引物5'-TCTGCACTGCCAAGACTGAG-3';下游引物5'-TCGAGTTGTCCACAGTCAGC-3'。GAPDH:上游引物5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'；下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測 將各組細(xì)胞以每孔5000個(gè)的密度種植于96孔板，于種植后24 h及72 h分別使用CellTiter-Blue試劑盒測定各組細(xì)胞573 nm波長處的吸光度（A)值，并根據(jù)公式計(jì)算72 h時(shí)點(diǎn)相對于24 h時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞活力相對變化。細(xì)胞相對活力（%)=72 hA值/24 hA值×100%。

1.2.5 免疫印跡法檢測PPIA相關(guān)蛋白（CyPA）在過表達(dá)PPIA的HUVEC細(xì)胞模型中的表達(dá)情況 從裂解液中取樣，加入SDS loading buffer，沸水煮5 min使蛋白變性。采用電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，之后在一抗抗體稀釋液（5%牛奶稀釋）中4℃孵育過夜。將孵育過一抗的膜，用TBST洗膜后在二抗稀釋液（TBST稀釋）中室溫孵育45 min，再次洗膜、曝光、測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與生物信息學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理：計(jì)量資料采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t（方差齊）/t’（方差不齊）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。lncRNA在兩個(gè)樣品（實(shí)驗(yàn)組和對照組）中的表達(dá)量變化，用Fisher檢驗(yàn)；對于設(shè)置了生物學(xué)重復(fù)（過實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組;對照1組、對照2組、對照3組）的樣本，使用edgeR專用軟件、采用負(fù)二項(xiàng)分布數(shù)學(xué)模型進(jìn)行表達(dá)量差異分析。最后經(jīng)過Ttest檢驗(yàn)，篩選出表達(dá)變化的絕對比值（fold change，F(xiàn)C）≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因，F(xiàn)C≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因（所有差異性基因均滿足P＜0.05）。表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度（FDR）Q值≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cluster 3.0軟件進(jìn)行Cluster分析和圖形化展示。再根據(jù)分組信息，進(jìn)行差異比較，得到差異基因。綜合NCBI Ref Seq、NCBI Other、UCSC、ENSEMBL、Horaolog、LNCRNA-DB、ncRNA-SCAN、Agilent-G3、Agilent Other及Other Database等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的資源，對lncRNA的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 PPIA過表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果Q-PCR和Western blot檢測顯示，預(yù)期蛋白大小為17kDa，PPIA內(nèi)源性抗體在目的蛋白大小處檢測到特異性條帶，且實(shí)驗(yàn)組和對照組相比，蛋白表達(dá)量較高，提示PPIA過表達(dá)成功，見圖1。

圖1 PPIA過表達(dá)細(xì)胞檢測結(jié)果

2.2 PPIA過表達(dá)細(xì)胞的lncRNA檢測結(jié)果

2.2.1 PPIA過表達(dá)細(xì)胞的lncRNA類型分析 對參考基因組中已注釋的lncRNA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選出新預(yù)測lncRNA，對已注釋的lncRNA，根據(jù)其類型進(jìn)行分類，結(jié)果顯示：lincRNA占46.32%，antisense占43.68%，sense-intronic占8.27%，sense-overlapping占1.71%，macro-lncRNA占0.01%（圖2）。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)組與對照組的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞兩樣本間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)高，見圖3。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞間lncRNA差異分析 采用標(biāo)準(zhǔn)lncRNA差異分析（differentially expressed ln?cRNA,DElncRNA）流程進(jìn)行基礎(chǔ)分析數(shù)據(jù)提取，結(jié)果顯示，在差異表達(dá)lncRNA中，上調(diào)211個(gè)，下調(diào)91個(gè)，見圖4～5。

圖4 過表達(dá)組與對照組lncRNA差異性分析火山圖

圖5 差異lncRNA聚類分析結(jié)果

2.2.4 lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)分析 lncRNA的順式作用靶標(biāo)分析顯示，本項(xiàng)目多組比較中檢出的顯著差異表達(dá)lncRNA數(shù)目（DElncRNA）為302個(gè)，檢出的表達(dá)基因數(shù)目（expressed gene）為25 791個(gè)，上下游10 kb范圍內(nèi)有表達(dá)基因的顯著差異表達(dá)lncRNA數(shù)目（candidate lncRNA）為137個(gè)，上下游10 kb范圍內(nèi)的表達(dá)有顯著差異的lncRNA基因數(shù)目（up/down stream mRNA）為176個(gè)，滿足上述位置要求和共表達(dá)關(guān)系的lncRNA數(shù)目（re?maining lncRNA）為11個(gè)；滿足上述位置要求和共表達(dá)關(guān)系的lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)數(shù)目（cis target）為12個(gè)，進(jìn)入后續(xù)GO和KEGG分析。

3 討論

糖尿病患者的大血管病變主要以動脈粥樣硬化為主，心腦血管疾病等大血管并發(fā)癥是糖尿病的首要死亡原因[3]。糖尿病大血管病變涉及糖毒性、脂毒性、胰島素抵抗、炎癥通路激活、氧化應(yīng)激等的病理生理過程。其中，內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是動脈病變的起始環(huán)節(jié)。因此，深入研究內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制至關(guān)重要。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸單位的非編碼RNA，其可通過與特定DNA、RNA或蛋白質(zhì)部分結(jié)合，參與染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等，進(jìn)而參與各種疾病的調(diào)控[4-5]。lncRNA與編碼蛋白的mRNA相比，大多數(shù)lncRNA表達(dá)譜顯示其存在明顯的組織特異性[6-7]，這使lncRNA有潛力成為一些心血管疾病和糖尿病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子及治療靶點(diǎn)，并使其有望成為新型的疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

本研究結(jié)果顯示，HUVEC過表達(dá)PPIA引起后續(xù)的211個(gè)lncRNA上調(diào)，下調(diào)表達(dá)的lncRNA共91個(gè)。對lncRNA順式調(diào)控靶標(biāo)分析，共發(fā)現(xiàn)12對符合條件的lncRNA順式作用靶標(biāo)，其功能有待后續(xù)深入試驗(yàn)研究。有研究顯示:其多態(tài)性與動脈粥樣硬化和心梗相關(guān)，其兩個(gè)重要變異位點(diǎn)位于啟動子(-11G/C)和5'非編碼區(qū)（+36G/A）；冠心病患者觀察到PPIA rs6850:A＞G增加，同時(shí)，2型糖尿病患者也有PPIA rs6850:A＞G增加，此改變可引起血漿CyPA濃度增加[8]。Seizer等[9]研究顯示，血漿CyPA、CD147水平在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary artery atherosclerotic heart disease，CAD）患者中明顯升高。

RNA結(jié)合蛋白(RBP)是細(xì)胞內(nèi)RNA必不可少的結(jié)合伙伴，它們動態(tài)結(jié)合RNA，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用，參與RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列編輯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、維持RNA的穩(wěn)定和降解、細(xì)胞內(nèi)定位和翻譯控制等RNA代謝的多個(gè)方面[10]。目前未見關(guān)于CyPA作為RBP對lncRNA調(diào)控及其對內(nèi)皮細(xì)胞影響的研究報(bào)道。本研究結(jié)果為此方面的后續(xù)研究提供了思路。

lncRNA與多種心血管疾病和相關(guān)危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括病理性肥大、血管疾病、動脈粥樣硬化、血脂異常、炎癥反應(yīng)和代謝綜合征等[11-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些lncRNAs參與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的病理生理過程[15-16]，如參與糖代謝及胰島素抵抗。lncRNA在體液中往往與其他物質(zhì)形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，例如：外泌體，微粒，凋亡小體，脂蛋白和蛋白復(fù)合物等，提示lncRNA與mRNA、DNA相比，具有高度的穩(wěn)定型，更可能成為疾病生物標(biāo)記物。本研究顯示，PPIA過表達(dá)引起后續(xù)12對符合條件的lncRNA順式作用靶標(biāo)發(fā)生了改變，這些lncRNA可作為后續(xù)功能研究的備選基因。

綜上，CyPA作為新發(fā)現(xiàn)的RNA結(jié)合蛋白，其基因PPIA在HUVEC細(xì)胞的過表達(dá)可引起后續(xù)lncRNA的差異表達(dá)，為糖尿病與冠心病的相關(guān)性研究提供了依據(jù)。