郭云泉，王翠翠，岳 娜，胡佳捷

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830011）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率和致死率是全球最高的三大惡性腫瘤之一，CRC大多早期癥狀不明顯導(dǎo)致患者忽視身體表現(xiàn)，被診斷時(shí)已到中晚期。CRC起源于癌前病變，通常稱為直腸息肉。鋸齒狀腺瘤（serrated adenomas，SA）含有鋸齒狀隱窩結(jié)構(gòu)的特征，是介于增生性息肉和傳統(tǒng)腺瘤之間的腺體增生，早期內(nèi)鏡下多表現(xiàn)為無(wú)蒂齒狀腺瘤及混合性息肉，并且存在不穩(wěn)定性異質(zhì)損害，進(jìn)一步可演變成CRC。SA病理特征為隱窩上皮有“鋸齒狀”外觀，有報(bào)道顯示該類特征演變發(fā)生腺癌的可能性在1%左右，是結(jié)直腸重要的致癌途徑之一[1]，在最新的WHO指南中，具有惡變可能性的SA包括無(wú)蒂SA/息肉（SSA/P）和傳統(tǒng)SA（TSA）。BRAF是人類最重要的原癌基因之一，BRAF絕大部分突變形式為BRAF V600E突變，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)重要信號(hào)傳導(dǎo)角色，BRAF的蛋白是有絲分裂原活化的蛋白激酶細(xì)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）途徑蛋白，是一種高效的磷酸化劑，在凋亡和增殖過(guò)程中起著重要作用，而通路入口處的MAPK可通過(guò)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子鏈接細(xì)胞表面受體和蛋白，激活多種效應(yīng)蛋白，從而使細(xì)胞對(duì)外來(lái)信號(hào)產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答。有研究顯示BRAF V600E蛋白可在多種癌前病變中早期表達(dá)[3]。本研究對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的80例SA患者進(jìn)行研究，探討B(tài)RAF V600E蛋白表達(dá)在SA患者中的診斷意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇本院消化腫瘤科2017年5月－2020年4月確診的80例SA患者，男性38例，女性42例，≤50歲26例，＞50歲54例，平均年齡（57.32±4.61）歲，其中高度異型增生20例、中度異型增生36例、低度異型增生24例。另收集同期在院就診經(jīng)內(nèi)鏡或手術(shù)切除并無(wú)病例確診的結(jié)直腸增生性息肉標(biāo)本40例、CRC組織標(biāo)本40例作為對(duì)照觀察。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)檢查確診SSA/P、TSA者，具有典型的鋸齒狀腺管樣結(jié)構(gòu)的。（2）能完整獲取結(jié)腸鏡檢查資料，包含腫瘤大小、形態(tài)、數(shù)量等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有消化道惡性腫瘤及術(shù)后患者。（2）炎性腸病穩(wěn)定期或恢復(fù)期。（3）伴有嚴(yán)重心血管疾病、溝通障礙者。

1.3 方法采用兔抗人BRAF V600E抗體（中杉金橋公司，克隆號(hào)RM8，可檢測(cè)BRAF基因V600E的突變）；PV9000試劑盒使用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，一抗稀釋度為1∶600，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)3，3一二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色，操作如下：取5μmSA厚切片60℃烤箱烤片5 h，二甲苯脫蠟3次各10 min后梯度酒精各10 mim，通過(guò)滴加3%過(guò)氧化氫液室放入溫室避光孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，在使用蒸餾水沖洗PBS洗3次。將BRAF浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，入微波爐中溫度100℃、火力20加熱10 min，自然冷卻后PBS沖洗2 min×3次，濾紙吸干PBS液。滴加BRAF(1∶600)入濕盒內(nèi)冰箱過(guò)夜，溫度設(shè)置4℃，次日PBS沖洗2 min×3次，再滴入通用型抗體-PV9000，37℃室溫孵育l5 min，PBS沖洗2 min×3次。滴入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫下孵育15 min。二氨基聯(lián)苯氨底物顯色，顯色時(shí)間10～20 min，顯微鏡下觀察顯色，發(fā)現(xiàn)背景出現(xiàn)后立即控制放入水中止顯色，給予蘇木素20 s染色，自來(lái)水沖洗后用1%鹽酸酒精分化2 s，自來(lái)水復(fù)洗氨水反藍(lán)1 s再次沖洗。最后通過(guò)75%、90%、100%酒精各5 min，二甲苯3次各10 min脫水透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS液代替一抗作為陰性進(jìn)行對(duì)照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)BRAF V600E蛋白染色出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)文獻(xiàn)[4]方法，選患者典型腺上皮區(qū)域進(jìn)行400倍鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為0、1、2、3個(gè)分?jǐn)?shù)，分別代表陽(yáng)性性細(xì)胞數(shù)0、＜25%、≤25%～50%、≤51%～75%、＞75%。不同分?jǐn)?shù)染色強(qiáng)度分別代表無(wú)染色、淡棕黃色、棕黃色、深褐色。1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS17.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得計(jì)數(shù)資料按率（%）表達(dá)，并使用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中BRAF V600E蛋白檢出情況

BRAF V600E蛋白在結(jié)直腸癌（colorectal can?cer，CRC）、鋸齒狀腺瘤和增生性息肉中均有不同比例的表達(dá)，三者間BRAF V600E陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中HP明顯低于SA，而CRC明顯高于SA，見(jiàn)表1。不同組織的病理表現(xiàn)見(jiàn)圖1。

2.2 BRAF V600E表達(dá)水平與SA患者臨床參數(shù)的關(guān)系BRAF V600E表達(dá)水平與SA患者的年齡、性別無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05），但而隨著SA異型增生程度的加重，BRAF V600E蛋白基因表達(dá)水平也隨之增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 BRAF V600E在CRC患者結(jié)直腸黏膜中的檢出率對(duì)比/例（%）

圖1 不同組織的病理表現(xiàn)

表2 BRAF V600E表達(dá)與SA患者臨床參數(shù)的關(guān)系/例（%）

2.3 BRAF V600E表達(dá)水平與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系BRAF V600E表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中表達(dá)水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 BRAF V600E表達(dá)水平與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系/例（%）

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多個(gè)基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，包括癌基因的激活或抑制失活。其中，BRAF是參與癌基因的激活、凋亡以及基因功能紊亂調(diào)節(jié)等過(guò)程的重要基因，是引發(fā)CRC的演進(jìn)的主要信號(hào)分子之一。BRAF是一種蛋白激酶，能夠參與MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，與生長(zhǎng)因子結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、遷移及分化，臨床上癌癥患者中發(fā)現(xiàn)BRAF致癌變異大約有8%，而CRC患者診斷中，約15%存在BRAF基因突變[5-6]，突變基因轉(zhuǎn)錄并翻譯為BRAF V600E蛋白。BRAF V600E蛋白受負(fù)電荷基因模仿的活化區(qū)磷酸化改變不受依賴，導(dǎo)致前有絲分裂原有效分裂能力的增強(qiáng)，促使細(xì)胞異常繁殖和分化新成腫瘤。有關(guān)研究顯示[7-8]，BRAF V600E蛋白轉(zhuǎn)染到黑色素細(xì)胞中，會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞形態(tài)的惡性轉(zhuǎn)化，將該細(xì)胞株接種到裸鼠體內(nèi)能發(fā)現(xiàn)其呈侵襲性生長(zhǎng)，并導(dǎo)致腫瘤形成。

有學(xué)者通過(guò)分析結(jié)直腸息肉患者中的55個(gè)異型隱窩灶（ACF），結(jié)果顯示在33例非鋸齒狀病變中僅有1例檢出BRAF變異，而16例鋸齒狀病變有10例檢出BRAF V600E變異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為發(fā)現(xiàn)鋸齒狀形態(tài)可能與BRAF變異有較強(qiáng)相關(guān)性[9]；此外，在增生性息肉（Hp），BRAF變異的發(fā)生率既往報(bào)道中在30%～40%不等[10]。本研究顯示，在SA、HP以及CRC中均可檢查出BRAF V600E突變蛋白，且SA陽(yáng)性率介于HP與CRC兩者之間。且進(jìn)一步分析了SA的異型增生程度與BRAF V600E蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，結(jié)果顯示，高度異型增生的SA組織中BRAF V600E蛋白陽(yáng)性率明顯提高，提示當(dāng)SA組織中BRAF V600E蛋白的表達(dá)量與結(jié)直腸息肉患者經(jīng)由鋸齒狀病變-腺癌途徑的癌變風(fēng)險(xiǎn)存在較強(qiáng)的相關(guān)性，因此可以早期明確診斷，判斷預(yù)后，并進(jìn)一步指導(dǎo)治療，提高臨床診療效果。

BRAF突變引起SA惡性演化的機(jī)制可能與其導(dǎo)致ERK、NF-KB活性和NIH3T2D轉(zhuǎn)化能力的提高有關(guān)。BRAF V600E蛋白通過(guò)對(duì)上述信號(hào)分子的影響改變整合素的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲、降低E-鈣黏素表達(dá)并增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的分泌[11-12]，進(jìn)而促進(jìn)惡變組織的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，因此可在CRC發(fā)生、發(fā)展及分化轉(zhuǎn)陰等過(guò)程中將起到重要作用。本研究顯示，在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中，BRAF V600E蛋白的表達(dá)水平明顯更高，提示BRAF V600E基因突變不僅與SA的癌變幾率有關(guān)，還與患者惡性轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

綜上所述，BRAF V600E蛋白在SA患者中具有早期診斷及預(yù)后判斷的作用，在結(jié)直腸SA中的表達(dá)量與異型程度呈正相關(guān)，也與CRC出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)SA進(jìn)展趨勢(shì)及癌變的不良預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為早期診斷及預(yù)后判斷的重要分子。通過(guò)BRAF V600E蛋白水平檢查能夠反映SA患者病情的發(fā)展變化，值得臨床推廣運(yùn)用。