伊麗米熱·吾甫爾，庫熱西·玉努斯，國魯源，卡斯木江·阿西木江，吳桂霞

（新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011）

結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球發(fā)病率和致死率都很高的消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。盡管手術(shù)、化療、放療及生物療法已成為治療結(jié)腸癌的主要方法，但毒副作用大，長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性。腫瘤的化學(xué)預(yù)防是使用天然、合成或生物制劑來預(yù)防、抑制或逆轉(zhuǎn)癌變的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。中草藥及其提取物具有許多生物活性成分，在腫瘤的化學(xué)預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用[4]。昆侖雪菊是菊科金雞菊屬，學(xué)名為兩色金雞菊，其黃酮類化合物在抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化等方面效果顯著[5]。但黃酮類多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的作用特點(diǎn)，也使其作用機(jī)制的現(xiàn)代化研究存在困難。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、藥理學(xué)等多個學(xué)科的技術(shù)，可以通過構(gòu)建藥物的“成分－靶標(biāo)－通路－疾病”網(wǎng)絡(luò)，更加深入地闡明中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合作用[6,7]。本文通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外細(xì)胞實驗，分析雪菊總黃酮對結(jié)腸腺癌細(xì)胞的抗瘤成分及作用機(jī)制，為其后續(xù)的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.2 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.2.1 昆侖雪菊總黃酮靶點(diǎn)預(yù)測 根據(jù)前期對昆侖雪菊總黃酮的提取及純化基礎(chǔ)工作及查閱文獻(xiàn)，在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP：https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以ADME參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出昆侖雪菊總黃酮的有效活性成分。再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測出總黃酮有效活性成分作用的潛在靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫以“Homo sapiens”(人屬)為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)換，將全部蛋白名稱均矯正為其官方名稱（official symbol）。

1.2.2 結(jié)腸癌相關(guān)基因的檢索 DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數(shù) 據(jù) 庫 以“Colorectal Carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)。通過STRING數(shù)據(jù)庫,輸入疾病靶點(diǎn)，物種設(shè)置為人類，得到人結(jié)腸癌疾病靶點(diǎn)。將查詢到的與結(jié)腸癌疾病靶點(diǎn)與昆侖雪菊總黃酮有效活性成分作用靶點(diǎn)取交集，篩選總黃酮治療結(jié)腸癌的共同靶點(diǎn)。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫，輸入上述靶點(diǎn)，隨后通過Cytoscape3.6.0進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，獲取潛在靶點(diǎn)。

1.2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和通路富集分析，并通過OmicShare(http://www.omic?share.com)平臺對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.4 “昆侖雪菊總黃酮-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape3.6.0軟件繪制“潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”和“昆侖雪菊總黃酮化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。將上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并。建立“昆侖雪菊總黃酮-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”。通過Network analyzer分析評價網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特性，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接 為了進(jìn)一步驗證靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果的可靠性，選取“昆侖雪菊總黃酮-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中前5個關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對接，驗證關(guān)鍵靶點(diǎn)與昆侖雪菊總黃酮活性成分之間的結(jié)合活性。

通信技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展為工程管理提供了更加便捷的交流渠道，也為工程管理的工作方式創(chuàng)新提供了更多可能。首先，可以利用網(wǎng)絡(luò)平臺吸引更多的供應(yīng)商參與建設(shè)；其次，可以利用通信技術(shù)實現(xiàn)各個部門間的協(xié)調(diào)溝通；再次，利用近年來發(fā)生較快的電商平臺開展采購活動，將所有采購活動透明化。對此，相關(guān)管理人員必須敢于打破行業(yè)“管理”，以全新的視角開展管理工作。

1.3 昆侖雪菊總黃酮對結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞的抗瘤作用

1.3.1 雪菊總黃酮的提取及純化 按照相關(guān)參考文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行雪菊總黃酮的提取及純化。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) Caco2細(xì)胞復(fù)蘇后加入到10%血清的1640培養(yǎng)基中，置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后傳代培養(yǎng)。

1.3.3 雪菊總黃酮提取物對Caco2細(xì)胞形態(tài)的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，不同濃度的雪菊總黃酮提取物（25、50、100、200、400、600、800μg/mL 100μL，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以未處理的細(xì)胞為空白對照組（Control組），倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3.4 CCK8法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期Caco2細(xì)胞，接種于96孔板中（1×104/孔），不同濃度雪菊總黃酮（25、50、100、200、400、600、800μg/mL）孵育細(xì)胞，以3μg/mL順鉑孵育的細(xì)胞為陽性對照組（DDP組）。藥物處理24、48、72 h后，每孔加入CCK8 2 h后，450 nm波長測各孔的OD值。按照如下公式計算細(xì)胞抑制率，抑制率=[(對照孔OD值-實驗孔OD值）/(對照孔OD值-空白孔OD值）]，半數(shù)抑制濃度(inhibi?tory concentration 50，IC50)值由GraphPad Priam 8軟件求出，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 對數(shù)期生長的Ca?co2細(xì)胞，以1×104/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，用50、100、200μg/mL的雪菊總黃酮孵育24 h，收集細(xì)胞后500μL的binding buffer重懸，先后加入FITC-An?nexin V和PI各5μL，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實驗 細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后用10μL槍頭在細(xì)胞層上垂直劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞。50、100、200μg/mL的雪菊總黃酮干預(yù)細(xì)胞24、48、72 h后，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并拍攝劃痕圖像。

1.3.7 Western blot檢測Caco2細(xì)胞中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的表達(dá) 收集1.3.5實驗方法中處理的各組Caco2細(xì)胞，RAPI液裂解后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，4℃過夜。Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9一抗（1：1 000）室溫4 h，二抗（1:1 500）室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，5 min/次?；瘜W(xué)發(fā)光法曝光至醫(yī)用X膠片上，灰度值掃描后統(tǒng)計處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組多組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗，若方差齊則采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的L S D法進(jìn)行多重比較；方差不齊時，改用DunnettT3檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的靶點(diǎn)預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1 總黃酮活性成分篩選 通過課題組前期基礎(chǔ)工作[8]及文獻(xiàn)查閱得到雪菊主要的化合物成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選得到昆侖雪菊總黃酮活性成分12個，活性成分的化學(xué)信息見表1。

2.1.2 總黃酮治療結(jié)腸癌共同靶點(diǎn)選擇 將TCMSP數(shù)據(jù)庫和ETCM數(shù)據(jù)庫收集到的總黃酮的12個活性成分的靶點(diǎn)，在STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)換及去重，共得到193個化合物靶點(diǎn)。與DiSGeN?ET數(shù)據(jù)庫搜索的與結(jié)腸癌相關(guān)的靶點(diǎn)取交集得到167個總黃酮治療結(jié)腸癌的共同作用靶點(diǎn)，見圖1。

2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將167個總黃酮治療結(jié)腸癌潛在的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人類，排除游離的無相互作用蛋白，將minimum re?quired interaction score設(shè)置為highest confidence(0.900)，獲得蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，在Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示，節(jié)點(diǎn)的度值越大，說明節(jié)點(diǎn)越處于PPI網(wǎng)絡(luò)中心，越能發(fā)揮關(guān)鍵作用，將節(jié)點(diǎn)度大于等于11的63個節(jié)點(diǎn)篩選為昆侖雪菊總黃酮治療結(jié)腸癌的潛在靶點(diǎn)。

表1 昆侖雪菊提取物中的活性成分

圖1 雪菊總黃酮有效成分靶點(diǎn)-結(jié)腸癌靶點(diǎn)關(guān)系的韋恩圖

2.1.4 KEGG和GO富集分析結(jié)果 63個潛在靶點(diǎn)主要富集在92個信號通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、癌癥相關(guān)通路、HIF-1等信號通路，見圖3。根據(jù)P＜0.01確定了303個GO條目：主要涉及轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等生物過程；與胞質(zhì)、核質(zhì)等有關(guān)的細(xì)胞成分；與蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等有關(guān)分子功能。

圖2 雪菊總黃酮治療結(jié)腸癌潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 潛在靶點(diǎn)KEGG通路及GO富集分析

2.1.5 “總黃酮-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析 通過反向?qū)ふ腋患治龅玫降?5個主要通路所對應(yīng)靶點(diǎn)及雪菊總黃酮活性成分，在Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建“昆侖雪菊總黃酮-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)模型（圖4）。11個化合物通過15條途徑與58個靶蛋白相互作用。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯玫紻egree(平均連接度為9.95)大于10的15個蛋白靶點(diǎn)，為雪菊總黃酮干預(yù)結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接 將“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與雪菊總黃酮潛在活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表2?；钚曰衔锱c受體分子對接模式見圖5。

圖4 雪菊總黃酮-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表2 核心靶蛋白與總黃酮活性成分對接結(jié)果

圖5 分子對接模式圖

2.2 藥理活性驗證實驗

2.2.1 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞增殖及形態(tài)的影響CCK8結(jié)果顯示，總黃酮提取物對Caco2細(xì)胞干預(yù)24、48、72 h后，半抑制濃度(IC50)分別為144.5、69.11、65.47μg/mL。總黃酮提取物對Caco2細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)具有一定的濃度及時間依賴性（P＜0.05），見圖6。倒置顯微鏡下觀察到與空白對照組相比，隨著總黃酮濃度的增加，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、邊界不清，與周圍細(xì)胞脫離，生長狀態(tài)差，見圖6。

圖6 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞增殖的影響

2.2.2 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖7所示，與空白對照組相比，隨著雪菊總黃酮濃度的增加，Caco2細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P＜0.05)。

圖7 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞凋亡的影響

2.2.3 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示（圖8），與空白對照組劃痕愈合程度相比，雪菊總黃酮干預(yù)組劃痕愈合明顯被抑制（P＜0.05），且抑制作用具有一定的濃度及時間的依賴性。

圖8 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞遷移的影響

2.2.4 雪菊總黃酮對Caco2細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，50μg/mL雪菊總黃酮明顯上調(diào)了Bax/Bcl-2的比值（P＜0.05），但100、200μg/mL總黃酮處理細(xì)胞后Bax/Bcl-2的比值有所上調(diào)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Caspase-3、MMP-9在100，200μg/mL總黃酮處理組明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖9 Western blot檢測各組細(xì)胞中蛋白的相對表達(dá)

3 討論

現(xiàn)代藥效學(xué)研究表明新疆昆侖雪菊富含多酚類、黃酮類、多糖、皂苷類等多種化學(xué)成分[10-11]。昆侖雪菊中的原花青素對小鼠肝癌細(xì)胞系（H22細(xì)胞）、宮頸癌細(xì)胞系（HeLa細(xì)胞）、人食管癌細(xì)胞（Eca-109細(xì)胞）的抗瘤作用[5]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了“總黃酮-靶點(diǎn)-疾病”的多層次相互作用網(wǎng)絡(luò)，從分子水平揭示雪菊總黃酮抗瘤的藥效作用基礎(chǔ)及機(jī)制。

本研究利用TCMSP網(wǎng)絡(luò)分析平臺，以O(shè)B≥30%和DL≥0.15為條件，篩選出昆侖雪菊總黃酮包括兒茶素、香葉木素、落新婦苷等12個主要的有效活性成分。通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫得到167個總黃酮治療結(jié)腸癌的共同作用靶點(diǎn)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出63個關(guān)鍵的抗瘤靶點(diǎn)。將所得靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，靶點(diǎn)主要富集于轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞的增殖、凋亡及周期調(diào)控等生物過程；此外靶點(diǎn)還富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能及胞核、胞質(zhì)等細(xì)胞組分。KEGG通路富集結(jié)果顯示，63個靶點(diǎn)富集顯著的前15條信號通路中，主要涉及PI3K-Akt、癌癥相關(guān)通路、HIF-1、TNF等信號通路。構(gòu)建“總黃酮-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，由15條信號通路通過反向富集分析篩選出AKT1、MAPK1、TP53、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、EGFR等15個總黃酮對結(jié)腸癌的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)。將“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與雪菊總黃酮潛在活性成分進(jìn)行分子對接，了解雪菊總黃酮中抗瘤的活性成分和結(jié)腸癌分子靶點(diǎn)之間相互作用方式，結(jié)果表明，雪菊總黃酮的活性成分與結(jié)腸癌交集的靶標(biāo)蛋白具有較好的結(jié)合活性。

已有研究表明植物黃酮（如黃芩素、香葉木素等）可以通過干擾PI3K-Akt信號通路，調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)分子如Bax、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9等的表達(dá)，從而加速腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，達(dá)到抗腫瘤的作用[12-13]。黃芩素對濾泡性甲狀腺未分化癌細(xì)胞的增殖抑制作用是通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡及自噬[14]。香葉木素對非小細(xì)胞肺癌的抗瘤作用可以通過PI3K/Akt/GSK-3β/Nrf2通路，誘導(dǎo)凋亡并提高紫杉醇的化療作用[15]。本研究結(jié)果顯示：雪菊總黃酮明顯抑制了Caco2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞遷移；Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，雪菊總黃酮上調(diào)了Bax/Bcl-2的比值，下調(diào)了Caspase-3、MMP-9蛋白的表達(dá)。

綜上，雪菊總黃酮可通過多靶點(diǎn)、多途徑實現(xiàn)干預(yù)Caco2細(xì)胞的作用，其抗腫瘤活性可能與影響B(tài)ax、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9的表達(dá)有關(guān)，PI3K-Akt信號通路可能是主要的機(jī)制。