阿爾孜古麗·吐爾遜，楊麗菲，鄭樹濤，，劉 清，，劉 濤，4，張琪琪，韓秀娟，盧曉梅，

（1新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院，2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)科一病區(qū)，3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室,烏魯木齊，830011;4新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科,烏魯木齊 830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）仍是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。食管癌組織學(xué)類型分為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（adenocarcinoma of the esophagus，EADC），前者占我國所有食管癌患者的90%[2]。

由于食管癌起病隱匿，初診時多數(shù)患者因處于中、晚期而失去手術(shù)治療機會，因而五年生存率約為15%～25%[3]。外泌體是一類細(xì)胞自主釋放、大小統(tǒng)一、直徑在30～150 nm的微型小泡,研究發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移的多階段中均發(fā)揮重要作用[4]。因此，從外泌體層面了解ESCC發(fā)生發(fā)展機制進而指導(dǎo)臨床治療與干預(yù)有著重要現(xiàn)實意義。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為研究高通量復(fù)雜蛋白的主流工具。而采用數(shù)據(jù)非依賴性采集高分辨率色譜-質(zhì)譜技術(shù)（data independent acquisition liquid chro?matography-mass spectrometry,DIA LC-MS）研究ES?CC患者外周血外泌體組學(xué)的研究較少，因此本研究采用DIA LC-MS技術(shù)分析ESCC患者及食管良性疾病患者外周血外泌體蛋白圖譜，并通過生物信息學(xué)技術(shù)找出差異蛋白并進行分析，從而揭示食管癌發(fā)生發(fā)展的分子分型調(diào)控機制，為該病的早期診斷和后期治療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及策略。

1 材料與方法

1.1 研究對象本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（K-2019054），標(biāo)本的獲取征得患者知情同意。用于外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的分析樣本包括3例III期ESCC患者和3例食管良性疾病患者，ESCC患者均為潰瘍型，食管良性疾病患者均為食管平滑肌瘤患者，上述人群無糖尿病且均行手術(shù)治療并通過手術(shù)后病理明確分期。

1.2 儀器與試劑超速離心機、EASY-nLCTM 1200 UHPL、Q ExactiveTM系列質(zhì)譜儀（美國Thermo）；透射電鏡（日本ZETA）；粒徑分析儀（福建福流生物）。食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家重點實驗室饋贈；CD9、CD81抗體購自美國Proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌體的分離與純化 抽取患者外周血4 mL，2 000 g離心10 min留取血漿。隨后4℃條件下依次離心4 000 g×20 min、12 000 g×30 min，0.22μm濾器過濾留取血漿，后超速離心機100 000 g×60 min離心2次，最終將沉淀重懸于PBS中用于后續(xù)分析。

1.3.2 外泌體鑒定 透射電鏡拍照：取外泌體樣本5μL滴加在銅網(wǎng)上，室溫孵育5 min后向銅網(wǎng)上滴加一滴2%的乙酸雙氧鈾，室溫干燥20 min后上機觀察。納米微粒追蹤（nanoparticle tracer analysis，NTA）檢測粒徑：PBS重懸外泌體稀釋至合適的濃度后，樣品上機檢測顆粒的粒徑分布。免疫印跡法（Western-blot，WB）檢測CD9、CD81蛋白表達(dá)：RIPA裂解液裂解外泌體，后使用BCA定量試劑盒檢測外泌體蛋白濃度，外泌體上樣量為50μg，電泳時選擇10%的分離膠和4%的濃縮膠制備聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳時濃縮膠以70 V電泳，約30 min后進入分離膠調(diào)整電壓為100 V。采用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜，100 V轉(zhuǎn)膜120 min，室溫封閉2 h后將膜置于1∶1 000的CD9、CD81的一抗稀釋液中4℃搖床過夜，第二天TBST洗膜3次后山羊抗兔二抗孵育1 h后洗膜曝光顯影。

1.3.3 質(zhì)譜蛋白酶解 取蛋白樣品120μg，加入蛋白溶解液補足體積至100μL，后加入胰酶（約1.5μg）和100 mM TEAB緩沖液（約500μL），充分混勻后于37℃酶切4 h。隨后加入胰酶和CaCl2酶切過夜。然后調(diào)節(jié)pH小于3（使用甲酸），混勻后于室溫、12 000 g離心5 min，取上清緩慢通過C18除鹽柱，之后使用0.1%甲酸和3%乙腈配置的清洗液清洗3次，再加入適量0.1%甲酸和70%乙腈配置的洗脫液，收集濾液，凍干。

1.3.4 質(zhì)譜方法 數(shù)據(jù)依賴式采集模式（Data inde?pendent acquisition，DDA）：將酶解后的多肽樣本溶解在12μL的A液（0.1%甲酸的水,含0.4μL的i RT標(biāo)準(zhǔn)肽）中,然后在EASY-nLCTM-1200 UHPLC色譜系統(tǒng)上進樣1μg。采用正離子掃描,范圍為350～1 500 m/z。一級掃描模式為全掃描,一級檢測軌道分辨率120 000（200 m/z），自動增益控制為3×106,最長注射離子時間為80 ms。二級檢測軌道分辨率15 000（200 m/z），自動增益控制為5×104,最長注射離子時間為45 ms。DIA數(shù)據(jù)采集:一級掃描模式為全掃描,范圍為350～1 500 m/z,一級檢測軌道分辨率60 000（200 m/z），自動增益為1×106，最長注射離子時間為20 ms。使用高能碰撞方法碎裂行二級質(zhì)譜檢測，窗口為50個固定窗口,生成質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)。

1.3.5 差異蛋白生物信息學(xué)分析 采用軟件Pro?teome Discoverer 2.2（PD2.2，Thermo）對DDA數(shù)據(jù)進行分析,將搜庫結(jié)果導(dǎo)入軟件Spectronaut（version 9.0，Biognosys）以此生成譜圖庫。隨后進行數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)提取。將篩選分析出的差異蛋白使用inter?proscan軟件作基因本體（gene ontology,GO）與京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。將從蛋白質(zhì)的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分進行基因本體分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件處理，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。當(dāng)?shù)鞍棕S度（Fold change，F(xiàn)C）上調(diào)達(dá)到1.5倍以上或下調(diào)0.67倍以下,且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其值小于0.05時,視為差異蛋白。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定透射電鏡觀察提取細(xì)胞外囊泡形狀為圓形囊泡與雙層膜結(jié)構(gòu)；NTA分析顯示的細(xì)胞外囊泡直徑范圍為30～150 nm；WB檢測提示細(xì)胞外囊泡表達(dá)CD9、CD81。以上數(shù)據(jù)表明所分離出的ESCC患者外周血細(xì)胞外囊泡為外泌體（圖1）。

2.2 III期ESCC患者與食管良性疾病患者外周血外泌體蛋白圖譜特征通過DIA LC-MS的質(zhì)譜定量技術(shù)，本研究對3例III期ESCC患者和3例食管良性疾病患者進行了蛋白圖譜分析,結(jié)果表明上述6例患者外周血外泌體中共檢測到1018個蛋白（圖2）。基于蛋白質(zhì)粗篩后的信息，以FC＞1.5及FC＜2/3和P＜0.05為診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇上調(diào)或下調(diào)的蛋白。最終，共篩選出21個差異蛋白，其中包括10個過度表達(dá)基因（紅點）和11個下調(diào)基因（綠點）（圖3）。

圖1 c:外泌體蛋白WB顯影圖圖1 ESCC來源外周血外泌體的鑒定

圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)

圖3 差異蛋白火山圖

2.3 基于差異蛋白的生物學(xué)功能和通路分析針對以上21個具有顯著性差異的蛋白,進一步做了富集分析,結(jié)果表明:細(xì)胞組分本體中主要涉及的細(xì)胞黏附和代謝,包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞間黏附以及核苷酸代謝、磷酸戊糖代謝等過程。細(xì)胞組分本體中主要富集的是胞質(zhì)成分。而對于分子功能本體而言,則涉及多個酶活性（比如2，3-環(huán)核苷酸-3磷酸酯、七磷酸七戊酮糖、肽酶活性等）（圖4）。在對這些差異蛋白進行KEGG通路分析后顯示：葉酸代謝通路、核糖體代謝通路、蛋白質(zhì)生物合成、補體以及凝血等通路可能與食管鱗癌的發(fā)展密切相關(guān)（圖5）。

圖4 基于差異蛋白的GO功能分析

圖5 基于差異蛋白的KEGG通路分析

3 討論

外泌體由脂質(zhì)雙分子層包裹著大量的核酸物質(zhì),包括小RNA、信使RNA、piwiRNA、核糖體RNA、長非編碼RNA、小核RNA、小核仁RNA以及線粒體DNA,它在細(xì)胞間通訊發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究對食管良性疾病患者和III期ESCC患者外周血外泌體進行了提取、鑒定，提示成功提取外泌體，隨后行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。本研究中共鑒定到1018種蛋白，依據(jù)FC上調(diào)達(dá)到1.5倍以上或下調(diào)0.67倍以下，共得到21種差異蛋白，通過對這些差異蛋白行GO分析提示細(xì)胞黏附和代謝參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究探索ESCC患者與食管良性疾病患者外周血外泌體蛋白質(zhì)譜差異，這將有利于我們從外泌體功能層面研究ESCC的發(fā)生發(fā)展機制,以此發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物標(biāo)志物，從而為食管癌的早期診斷和后期療效評價提供理論支持。

本研究中，鑒定到包括細(xì)胞黏性分子、蛋白修飾酶、結(jié)構(gòu)蛋白等多種蛋白。與其他癌腫的外周血外泌體蛋白質(zhì)譜研究相比[7-9],本研究鑒定出來的蛋白質(zhì)種類廣泛、數(shù)目多。首先我們選擇了外泌體提取的經(jīng)典方法-差速離心法。有研究發(fā)現(xiàn)差速離心法較商業(yè)化試劑盒提取外泌體純度高[10]、鑒定蛋白質(zhì)種類多。此外，我們選擇了既高通量又定量精準(zhǔn)重復(fù)性高的DIA法。對于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要采用DDA技術(shù)，然而該數(shù)據(jù)采集模式具有重復(fù)性差、定量不精準(zhǔn)、數(shù)據(jù)缺失多、低豐度蛋白難以檢測等固有缺點。因此在對成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣本研究有一定的限制性。而DIA法則將所有質(zhì)譜掃描范圍分為若干窗口,且循環(huán)、高速地對每個窗口的所有母離子進行選擇、碎裂、檢測,無遺漏地獲得樣本中所有母離子信息。因而DIA法具有更高的蛋白覆蓋度[10]。本研究鑒定蛋白數(shù)目多，這將對探尋食管癌外泌體功能有一定指導(dǎo)意義。

本研究對差異蛋白行GO功能分析與KEGG通路富集研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附、代謝通路的激活可能在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要而關(guān)鍵作用。惡性腫瘤最主要的特點就是浸潤與轉(zhuǎn)移，而腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，其中重要環(huán)節(jié)就是脫落的腫瘤細(xì)胞通過血液、淋巴液循環(huán)定植在遠(yuǎn)隔器官形成轉(zhuǎn)移灶。多項研究表明外泌體是腫瘤生長的重要參與者[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)黏附相關(guān)蛋白在外泌體中富集豐度高，這將有利于深入了解外泌體介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移過程，同時將對腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)提供理論支持。此外，本研究發(fā)現(xiàn)代謝相關(guān)通路的激活，尤其是葉酸代謝通路的異常在腫瘤發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用，既往已有研究發(fā)現(xiàn)在不同分期食管癌患者血清中葉酸含量與臨床分期存在關(guān)聯(lián)性[15]，且基礎(chǔ)研究亦發(fā)現(xiàn)葉酸代謝紊亂與食管鱗狀上皮損傷相關(guān)[16]。代謝通路的異常改變有助于進一步了解腫瘤代謝及其對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。

綜上所述，本研究從人外周血中提取出外泌體且完成鑒定工作。通過對ESCC和食管良性疾病患者外泌體行蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附和代謝異常可能是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要過程。雖然本實驗未對上述差異蛋白行大樣本驗證，但本研究將豐富對食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識。