張春曉,冉從國,徐志斌,王麗麗

(河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院,河北石家莊 050018)

重組蛋白對(duì)工業(yè)、醫(yī)療保健和可持續(xù)的生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義,因此,建立高質(zhì)、高量蛋白質(zhì)高效生產(chǎn)平臺(tái)很有必要[1]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,或B.subtilis)被認(rèn)為是一種生物安全菌株,并且具有遺傳穩(wěn)定性高和蛋白分泌能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),常被用于細(xì)胞工廠生產(chǎn)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域重組蛋白,如蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶等[2]。

枯草芽孢桿菌胞外蛋白分泌系統(tǒng)主要有一般分泌途徑(Sec)、雙精氨酸分泌途徑(Tat)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和非經(jīng)典途徑等[3],其中大部分蛋白質(zhì)以Sec途徑進(jìn)行分泌。生命領(lǐng)域中絕大多數(shù)分泌蛋白在其N端攜帶短肽,一般含25～30個(gè)氨基酸殘基,稱為信號(hào)肽,就像全球定位系統(tǒng)一樣,導(dǎo)向靶蛋白到達(dá)最終目的地[4-6]。信號(hào)肽包含N區(qū)、H區(qū)和C區(qū)3部分[1,3-4],帶正電荷的N區(qū),含有賴氨酸或精氨酸殘基;疏水性H區(qū),由一連串疏水殘基組成,可能采用α-螺旋構(gòu)象,在這個(gè)疏水核心區(qū)的中間,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)螺旋斷裂的甘氨酸或脯氨酸殘基,從而形成一個(gè)可以插入膜的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu);親水性C區(qū),具有Ⅰ型信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn),含Ala-x-Ala共識(shí)基序[1,3]。信號(hào)肽除了被相應(yīng)的蛋白轉(zhuǎn)位酶靶向和膜易位所需要外,還對(duì)相應(yīng)的靶蛋白的生物合成、折疊動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性有額外的影響[7],信號(hào)肽的凈電荷、疏水性或長度的改變都會(huì)改變靶蛋白的分泌效率[8],且同一信號(hào)肽指導(dǎo)不同蛋白質(zhì)的分泌效率存在很大差異[9],目前尚未建立預(yù)測(cè)靶蛋白最適信號(hào)肽的相關(guān)軟件,因此,通過信號(hào)肽庫的構(gòu)建和篩選仍是提高目的蛋白分泌量的一種有效措施[9-10]。

在分析了N區(qū)正電荷數(shù)量、氨基酸組成及密碼子偏好性等方面的研究后,筆者得出,N區(qū)不像信號(hào)肽的H區(qū)和C區(qū)保守、被研究得透徹,在信號(hào)肽優(yōu)化中沒有發(fā)揮主要作用[4]。信號(hào)肽C末端由形成β-螺旋的氨基酸組成,在切除位點(diǎn)上游具有保守的(-3,-1)規(guī)則或AXA基序,提供信號(hào)肽酶結(jié)合位點(diǎn),涉及信號(hào)肽的切除[4]。盡管信號(hào)肽長度、電荷及疏水性不同,但其切除位點(diǎn)比較保守[4]。H區(qū)是信號(hào)肽研究的里程碑,其疏水性決定了:1)信號(hào)肽的構(gòu)象及面向細(xì)胞膜的方向;2)信號(hào)肽的切除,影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位速率和效率;3)信號(hào)肽的蛋白質(zhì)的分泌途徑;4)蛋白質(zhì)加工,如N連接的糖基化[4]。H區(qū)疏水氨基酸殘基的類型、順序和數(shù)量在不同生物中偏好性不同[4]。盡管很多研究在提高異源蛋白表達(dá)方面均對(duì)天然信號(hào)肽庫進(jìn)行篩選,并獲得了較好的適合目的蛋白的信號(hào)肽[11-12],但不一定是最佳信號(hào)肽。因此,本研究以α-淀粉酶為例,將篩選得到的4種天然信號(hào)肽(SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB)的H區(qū),替換SPsacB信號(hào)肽的H區(qū),構(gòu)建4種嵌合信號(hào)肽RSP1—RSP4,以期篩選出優(yōu)于天然信號(hào)肽的嵌合信號(hào)肽,實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶的更高效分泌。本研究有望為其他蛋白質(zhì)的高效分泌提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究所用質(zhì)粒包括pWB-manBl(I91N/L211I)[13],構(gòu)建的pWB-amyL(SPsacB信號(hào)肽指導(dǎo)的α-淀粉酶表達(dá)載體)、pWB-SPn-amyL(天然信號(hào)肽指導(dǎo)的α-淀粉酶表達(dá)載體,n代表不同天然信號(hào)肽)和pWB-RSPx-amyL(嵌合信號(hào)肽指導(dǎo)的α-淀粉酶表達(dá)載體,x代表1,2,3,4)。所用菌株包括實(shí)驗(yàn)室保藏的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),B.subtilisDB104[14]及新構(gòu)建的α-淀粉酶表達(dá)菌株B.subtilis(pWB-amyL),B.subtilis(pWB-SPn-amyL)和B.subtilis(pWB-RSPx-amyL)。引物見表1。

表1 引物種類Tab.1 Primers

1.2 試劑與儀器

Fastpfu,dNTP,DNA Marker、蛋白Marker,分析純,北京全式金生物技術(shù)有限公司提供;寡核苷酸引物,分析純,英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供;玉米淀粉(生物試劑),沈陽雷仕淀粉有限公司提供;3,5-二硝基水楊酸(DNS,生物試劑)、D-葡萄糖(生物試劑)、剛果紅染料(生物試劑)、瓊脂粉(生物試劑),北京索萊寶科技有限公司提供;酵母粉、蛋白胨和胰蛋白胨、分析純,OXOID公司提供。

ZWY-2102C振蕩搖床,上海智城分析儀器制造有限公司提供;Biometra Tone梯度PCR儀,德國耶拿公司提供;Quantity One凝膠成像系統(tǒng),美國BioRad公司提供;BIFUGE STRATOS高速冷凍離心機(jī),美國GE公司提供;SpectraMaxm i3x 多功能酶標(biāo)儀,美國 Molecular Devices 公司提供;恒溫金屬浴,杭州博日科技有限公司提供。

1.3 淀粉酶基因amyL擴(kuò)增及其表達(dá)載體構(gòu)建

以B.amyloliquefaciens基因組為模板,BFamy-5和BFamy-2為引物,擴(kuò)增amyL基因,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,61 ℃ 20 s,72 ℃ 25 s;72 ℃ 5 min,32個(gè)循環(huán)。以Vlinker-1和VBFamy-2為引物,質(zhì)粒pWB-manBl (I91N/L211I)為模板擴(kuò)增載體片段,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;再將2個(gè)PCR片段采用POE-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,95 ℃ 2 min;98 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,68 ℃ 6 min;68 ℃ 10 min,35個(gè)循環(huán)。將POE-PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至B.subtilisDB104感受態(tài)細(xì)胞,獲得淀粉酶表達(dá)菌株B.subtilis(pWB-amyL)。

1.4 天然信號(hào)肽庫的構(gòu)建及篩選

1.4.1 天然信號(hào)肽基因克隆

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)淀粉酶AmyS分泌效果較好的15種信號(hào)肽(SPyvcE,SPyoqM,yuaB,pelA,pelB,yoaW,yqxI,lipA,estB,yoqH,ybfO,SPsacB,SPBglS,yddT,SPyobB ybxI)[10],本研究又增加了8種常用蛋白酶信號(hào)肽(aprE,nprB,bpr,mpr,epr,nprE,vpr,wprA)以及ybxI和amyE信號(hào)肽共25種天然信號(hào)肽進(jìn)行克隆。以B.subtilisDB104基因組為模板,所用引物見表1。

1.4.2 載體擴(kuò)增

以pWB-amyL質(zhì)粒為模板,Vsip-1和Vsip-2為引物,擴(kuò)增5.2 kb載體骨架片段用于擴(kuò)增α-淀粉酶載體骨架,95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s,5個(gè)循環(huán);95 ℃ 20 s,61 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s;72 ℃ 5 min。

1.4.3 天然信號(hào)肽與載體片段融合

天然信號(hào)肽和載體片段純化后,將天然信號(hào)肽按分子量大小分為6組,通過POE-PCR方法克隆信號(hào)肽-載體骨架多聚體[15],95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,68 ℃ 6 min;35個(gè)循環(huán),68 ℃ 10 min。將POE-PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入至B.subtilisDB104感受態(tài)細(xì)胞,獲得淀粉酶天然信號(hào)肽庫B.subtilis(pWB-SPn-amyL)。

1.4.4 天然信號(hào)肽庫的篩選

將天然信號(hào)肽庫轉(zhuǎn)化產(chǎn)物平鋪在剛果紅篩選培養(yǎng)基上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h進(jìn)行初篩;從每組中挑取水解圈較大的10個(gè)克隆再次進(jìn)行剛果紅平板復(fù)篩,水解圈較大的進(jìn)行24孔板培養(yǎng)并測(cè)定酶活力,并從每組中選取3個(gè)酶活力較高的克隆進(jìn)行測(cè)序,鑒定信號(hào)肽種類。

云小辮：鑒于該同學(xué)簽名太有個(gè)性了，編編始終沒弄明白姓甚名誰，但是能夠掌握四門語言的意絲編編還是頭一次見到。增加笑話的建議編編也會(huì)慎重考慮，畢竟編編也是很了解你們的，打開意少率先看搞笑圖片和笑話的意絲應(yīng)該不在少數(shù)吧，哈哈！

1.5 嵌合信號(hào)肽庫的構(gòu)建

4種嵌合信號(hào)肽RSP1—RSP4序列由北京六合華大基因科技有限公司提供,PCR擴(kuò)增程序同天然信號(hào)肽。嵌合信號(hào)肽克隆所用引物為P25和P26,采用1.4.2方法構(gòu)建B.subtilis(pWB-RSPx-amyL)。

1.6 重組菌株發(fā)酵

挑取每種枯草芽孢桿菌工程菌株3個(gè)單克隆于種子培養(yǎng)基,37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12 h;按10%比例轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基,相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d,每隔1 d進(jìn)行取樣測(cè)定酶活力。

1.7 α-淀粉酶活力測(cè)定

采用DNS法測(cè)定α-淀粉酶活力[16]。不同工程菌粗酶液制備:取發(fā)酵液樣品,調(diào)至相同OD600,12 000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液。將玉米淀粉溶于pH 7.0的磷酸緩沖液,配制20 g/L的底物,在1.5 mL離心管中加入底物270 μL,再加入30 μL適當(dāng)稀釋的粗酶液,混合均勻后放入60 ℃恒溫水浴鍋,反應(yīng)10 min,取出后迅速加入600 μL的DNS試劑,混合均勻后放入100 ℃沸水浴5 min,迅速取出進(jìn)行冷水浴,測(cè)定樣品540 nm吸光值。配制不同濃度的葡萄糖,與DNS試劑混勻,沸水浴5 min,測(cè)定OD540值并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SigP 6.0進(jìn)行信號(hào)肽N,H和C區(qū)的分析[17]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析,p<0.05%差異性顯著,p<0.01%差異性極顯著。應(yīng)用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-淀粉酶基因分析

α-淀粉酶基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示,泳道1所示目的條帶位置與期望的1 545 bp α-淀粉酶基因大小一致,通過POE-PCR構(gòu)建載體pWB-amyL后,進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明與B.amyloliquefaciensα-淀粉酶基因(CP054415.1)一致性100%。該基因編碼514個(gè)氨基酸。經(jīng)SigP 6.0軟件預(yù)測(cè),前31個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。

圖1 α-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR results of α-amylase

2.2 α-淀粉酶天然信號(hào)肽庫的篩選

從每組轉(zhuǎn)化平板中挑取透明圈較大的10個(gè)單克隆進(jìn)行復(fù)篩,結(jié)果如圖2所示,每個(gè)克隆所產(chǎn)透明圈有明顯差異,每組挑取水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值較大的3個(gè)菌落,進(jìn)行液體培養(yǎng),測(cè)定α-淀粉酶活力,共挑取10個(gè)酶活力較高的菌株進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,篩選得到的對(duì)α-淀粉酶分泌效率較高的天然信號(hào)肽是SPyoqM,SPyobB,SPBglS,SPsacB,nprB和SPyvcE等6種信號(hào)肽。

圖2 α-淀粉酶天然信號(hào)肽庫復(fù)篩結(jié)果Fig. 2 2nd round screening for natural signal peptide library of α-amylase

注:與SPsacB信號(hào)肽相比,*表示差異性顯著(p<0.05%);**表示差異性極顯著(p<0.01%)。圖3 不同信號(hào)肽指導(dǎo)的α-淀粉酶相對(duì)酶活力Fig. 3 Relative enzyme activity of α-amylase enzyme by different signal peptides

2.3 嵌合信號(hào)肽對(duì)α-淀粉酶分泌的影響

由于SPsacB是B.subtilis常用的信號(hào)肽,SigP 6.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明其N區(qū)、H區(qū)和C區(qū)分別由MNIKKFAKQ,ATVLTFTTALL和AGGATQAFA短肽組成。本文以該信號(hào)肽為基礎(chǔ),將α-淀粉酶篩選得到的胞外酶活力較高的4種天然信號(hào)肽SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB的H區(qū)分別替換SPsacB的H區(qū),構(gòu)建嵌合信號(hào)肽RSP1,RSP2,RSP3和RSP4(如表2所示),以期通過α-淀粉酶信號(hào)肽N區(qū)、H區(qū)和C區(qū)的強(qiáng)強(qiáng)組合,實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶更加高效分泌。

表2 嵌合信號(hào)肽H區(qū)組成Tab.2 Hydrophobic region of chimeric signal peptides

結(jié)果表明,篩選得到的適合α-淀粉酶的嵌合信號(hào)肽為RSP1,其指導(dǎo)的胞外α-淀粉酶活力達(dá)968.5 U/mL(見圖3),較篩選的α-淀粉酶最適天然信號(hào)肽SPyoqM分泌效率提高27%;而其他嵌合信號(hào)肽RSP2,RSP3和RSP4指導(dǎo)的α-淀粉酶胞外酶活力約為SPsacB信號(hào)肽的10%左右。RSP1與SPsacB的N區(qū)和C區(qū)相同,僅H區(qū)不同,但RSP1指導(dǎo)α-淀粉酶的分泌效率是SPsacB的3.07倍;此外,盡管RSP1與SPyvcE信號(hào)肽H區(qū)相同,但RSP1指導(dǎo)α-淀粉酶的分泌效率為SPyvcE信號(hào)肽的4.6倍;SPyoqM與 RSP2相比,信號(hào)肽的H區(qū)相同但N區(qū)和C區(qū)不同,SPyoqM對(duì)α-淀粉酶的分泌效率是RSP2的21.9倍。SPsacB與4種嵌合信號(hào)肽對(duì)α-淀粉酶的分泌效率都達(dá)到極顯著水平(p<0.01%)。圖4 b)為發(fā)酵4 d的粗酶液電泳結(jié)果,只有嵌合信號(hào)肽RSP1指導(dǎo)的α-淀粉酶有明顯的55.4 kDa的目的條帶(圖中黑色箭頭所示),其他嵌合信號(hào)肽無明顯的α-淀粉酶目的條帶,與酶活力測(cè)定結(jié)果一致。應(yīng)用嵌合信號(hào)肽指導(dǎo)外源蛋白的高效分泌報(bào)道較少,僅見對(duì)修飾的信號(hào)肽SPdsbA和SPpelB特定區(qū)域進(jìn)行交換,在大腸桿菌(Escherichiacoli)中提高金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) Alpha toxinH35L的分泌[18],未見應(yīng)用嵌合信號(hào)肽指導(dǎo)α-淀粉酶分泌的報(bào)道。

2.4 信號(hào)肽組成對(duì)蛋白分泌效率的影響

重組蛋白的產(chǎn)量,不僅與表達(dá)水平相關(guān),也與轉(zhuǎn)位效率相關(guān),而分泌機(jī)器和信號(hào)肽,決定了蛋白的分泌效率[4]。同源或異源信號(hào)肽篩選、信號(hào)肽突變等策略,是提高靶蛋白產(chǎn)量的有效措施[10,19-20]。YANG等[21]應(yīng)用信號(hào)肽工程包括信號(hào)肽優(yōu)化、對(duì)信號(hào)肽SPywbN′刪除29—45位肽段、在第4和第5位插入精氨酸R、降低H區(qū)疏水性等多項(xiàng)措施,并結(jié)合啟動(dòng)子工程及高密度發(fā)酵,使堿性α-淀粉酶產(chǎn)量提高250.6倍。信號(hào)肽的變化改變了易位效率、裂解位點(diǎn),甚至裂解后過程[4]。

4種嵌合信號(hào)肽RSP1—RSP4的N區(qū)和C區(qū)均來自SPsacB,僅H區(qū)不同,其氨基酸組成見表2。首先,從疏水性氨基酸殘基數(shù)目來看,RSP1和RSP3疏水性殘基均為9,而RSP2,RSP4和SPsacB的疏水性殘基個(gè)數(shù)為7,但RSP1指導(dǎo)α-淀粉酶的分泌效率遠(yuǎn)高于其他信號(hào)肽,說明疏水性氨基酸殘基數(shù)目較多,分泌效率較高,這與H區(qū)疏水性降低、蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)將變慢或完全停止結(jié)論一致[4,22]。但不是疏水性殘基越高越好,如果疏水性增加過多,大量具有非天然構(gòu)象的未成熟蛋白會(huì)堵塞在轉(zhuǎn)座酶后面,不僅會(huì)減少蛋白質(zhì)的分泌,還會(huì)威脅細(xì)胞的生存能力[4]。其次,從疏水性氨基酸殘基的分布來看,疏水性殘基之間插入螺旋阻斷(helix-breaker)殘基,使疏水殘基分布較均勻,優(yōu)于集中分布。RSP1和RSP3的疏水性殘基數(shù)目相同,但RSP1疏水性殘基被螺旋阻斷氨基酸G或S分割為4個(gè)區(qū)域,分布較均勻,而RSP3的疏水性殘基集中分布在H區(qū)的兩端,中間僅被1個(gè)G阻斷,說明信號(hào)肽分泌效率不僅與疏水性殘基數(shù)目多少有關(guān),還與疏水性殘基的分布相關(guān)。HAN等[18]認(rèn)為高效信號(hào)肽在H區(qū)中間或C區(qū)附近具有疏水殘基,如果疏水殘基在N區(qū)附近則會(huì)降低分泌效率。DALBEY等[23]則指出,H區(qū)螺旋阻斷殘基G,P和S在H區(qū)中間的插入使信號(hào)肽形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu),使信號(hào)肽更容易插入膜中并被SPase切割。再次,盡管H區(qū)在蛋白分泌過程中起著舉足輕重的作用,但僅H區(qū)不能決定蛋白分泌效率。RSP1與SPyvcE的H區(qū)完全相同,但N區(qū)和C區(qū)不同,RSP1指導(dǎo)α-淀粉酶的分泌效率是SPyvcE的4.6倍;α-淀粉酶的最適天然信號(hào)肽SPyoqM與 RSP2相比,信號(hào)肽的H區(qū)相同但N區(qū)和C區(qū)不同,使得SPyoqM是RSP2的21.9倍。HAN等[18]也認(rèn)為H區(qū)疏水殘基與另外2個(gè)區(qū)域之間存在相互作用?？傊?信號(hào)肽N,H和C區(qū)甚至目的蛋白之間與分泌機(jī)器共同作用,最終決定了靶蛋白的分泌效率。

3 結(jié) 語

本文提出將不同來源的天然信號(hào)肽N,H和C區(qū)進(jìn)行組合構(gòu)建嵌合信號(hào)肽的理念,且嵌合信號(hào)肽RSP1指導(dǎo)的α-淀粉酶分泌效率較最適天然信號(hào)肽SPyoqM提高了27%,表明嵌合信號(hào)肽是有效提高α-淀粉酶產(chǎn)量的一種方法。本研究對(duì)其他蛋白的高效分泌具有指導(dǎo)意義?？莶菅挎邨U菌中蛋白分泌過程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)和多種蛋白質(zhì),其中信號(hào)肽對(duì)目的蛋白分泌有著重要影響,但是,目前尚沒有一種確定的信號(hào)肽能夠指導(dǎo)任意靶蛋白的高效分泌,因此,需要對(duì)更多信號(hào)肽與靶蛋白分泌效率的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,建立信號(hào)肽結(jié)構(gòu)/序列與靶蛋白結(jié)構(gòu)/序列之間的關(guān)聯(lián),開發(fā)靶蛋白分泌效率的信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件,提高分泌效率和蛋白產(chǎn)量。