謝其亮，耿曉桐，汪港，周斌，楊偉明，陳瓊

1.河南羚銳制藥股份有限公司，河南 信陽465550；2.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽464000

半夏為天南星科植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.）Breit.］的干燥塊莖，據(jù)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院統(tǒng)計，在558種中藥處方中，半夏使用頻率居第22位［1］，并且在抗疫“三藥三方”中有二方均用到了半夏。半夏具有燥濕化痰［2］、降逆止嘔［3］、清痞散結(jié)［4］、鎮(zhèn) 咳［5－6］、鎮(zhèn) 吐［7－9］、抗 腫 瘤［10－11］、抗 生育［12－13］、降血脂［14］、治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。?5］等多種藥理作用。

息半夏是河南省信陽市息縣產(chǎn)旱半夏，因其個大、粉性足、品質(zhì)優(yōu)良、療效顯著廣受歡迎。多年來，息半夏以質(zhì)量地道，信譽卓著而馳名中外，在同類藥材中被視為珍品。近年來，隨著市場經(jīng)濟的快速發(fā)展，息半夏遠銷日、韓及歐美市場，長期供不應(yīng)求。但息半夏野生資源被過度采挖，加之農(nóng)田生態(tài)環(huán)境改變，部分地區(qū)息半夏野生資源已瀕臨滅絕［16］，目前栽培息半夏已形成一定的規(guī)模，但尚缺乏整體質(zhì)量評價。目前有關(guān)息半夏的質(zhì)量評價多為生物堿［17］、水分［18］等有效成分的質(zhì)量分析，但并未有文獻利用總生物堿、總有機酸、總灰分、浸出物等綜合指標對其進行整體分析。

息半夏化學(xué)成分復(fù)雜，含總生物堿［17］、總有機酸［2］、蛋白質(zhì)［3］、核苷［2］等成分，其中張科衛(wèi)等［19］發(fā)現(xiàn)半夏總有機酸成分具有鎮(zhèn)咳、祛痰作用，張啟龍等［20］發(fā)現(xiàn)半夏生物堿類成分對豚鼠回腸的收縮張力有明顯的抑制作用，推測可能是其防治化療性嘔吐的作用機制之一。此外，總灰分、浸出物在中藥材的質(zhì)量評價中也占據(jù)著一定的地位。中藥以多成分、多靶點、多層次發(fā)揮治療作用［21］，因此，本研究基于息半夏的總灰分、浸出物、有機酸、生物堿為考察指標，采用多組分對息半夏進行整體質(zhì)量評價，全面反映野生與栽培息半夏整體質(zhì)量特征。研究證實，栽培息半夏與野生息半夏質(zhì)量指標成分無明顯差異，為栽培息半夏的推廣應(yīng)用提供理論支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器紫外可見分光光度計（TU－1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機（T GL－16M，常州金壇良友儀器有限公司）；全自動滴定儀（T906，濟南海能儀器股份有限公司）；磨粉機（914B，中山市方天電器制造有限公司）；電熱套（ZHW，杭州振和儀器廠）；超聲波清洗器（KQ－500B，昆山市超聲儀器有限公司）；循環(huán)水真空泵（SH2－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠）；水浴振蕩器（SH－B，金壇市神科儀器廠）。

1.2 試劑鹽酸麻黃堿（中國藥品生物制品檢定所，批號：171241－201508，純度：99.7%）；氨水（分析純，德州金和化工經(jīng)貿(mào)有限公司，批號：20180402）、三氯甲烷（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號：20170802）、枸櫞酸（分析純，蘇州智翔精細化工有限公司，批號：180417）、枸櫞酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號：851067）、溴麝香草酚藍（分析純，上海撫生生物科技有限公司，批號：20190210）、乙醇（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號：20160704）、氫氧化鈉（分析純，濟南創(chuàng)世化工有限公司，批號：20181018）、鹽酸（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號：20180201）、純化水（自制）。

1.3 試樣樣品來自河南省信陽市息縣不同村莊的野生息半夏和栽培息半夏，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院副教授梁利香鑒定為息半夏。于2019年7月至11月每月10－15日，到采集地采集的半夏鮮品，每次隨機選取50～100株代表性半夏植株，去皮，干燥，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 水分的測定（烘干法）分別取粉碎過二號篩的樣品粉末2.0 g，置于干燥至恒質(zhì)量的稱量瓶中，精密稱定，于105℃條件下干燥5 h，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在105℃下繼續(xù)干燥1 h，放冷，精密稱定，至連續(xù)兩次稱質(zhì)量的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的質(zhì)量，計算供試品中含水量（%）。計算出的含水量數(shù)值僅供供試品其他質(zhì)量指標計算用。結(jié)果見表1，圖1。

表1 野生息半夏和栽培息半夏水分測定結(jié)果（%）

圖1 野生和栽培息半夏水分結(jié)果圖

由于水分是衡量息半夏的干燥程度，目的是為保證息半夏貯存期間的質(zhì)量，本研究水分不作為判定息半夏品質(zhì)的指標，僅參與后期半夏其他質(zhì)量指標的計算。

2.2 總灰分的測定分別取粉碎過二號篩混合均勻的供試品2.0 g，置于熾灼至恒質(zhì)量的坩堝中，稱定質(zhì)量（準確至0.01 g），通過設(shè)置緩緩升高溫度的方法緩慢熾熱，避免樣品燃燒，待樣品粉末完全炭化時，逐漸升高溫度至550℃，使樣品完全灰化并至恒質(zhì)量。根據(jù)剩余的殘渣質(zhì)量，計算不同月份的息半夏樣品的總灰分含量（%）。結(jié)果見表2，圖2。

表2 野生息半夏和栽培息半夏總灰分測定結(jié)果 （%）

圖2 野生和栽培息半夏總灰分結(jié)果圖

野生和栽培息半夏總灰分檢測結(jié)果呈現(xiàn)“N”型變化趨勢，且栽培息半夏總灰分略高于野生息半夏。部分樣品的總灰分含量高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的4.0%，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，半夏的灰分與其生長周期有直接關(guān)系，而本文考查的是7－11月份生長時期的半夏樣品，半夏的最佳采收期是6月底至7月初，這時半夏的灰分極少不合格，有機酸、浸出物等有效成分含量也最高，半夏處于倒苗期，此時適合半夏的采收；7月底至8月份半夏的灰分達到峰值，到11月后半夏的灰分會達到第2個峰值，特別是有些多年生的半夏灰分就會超標，如果是重新種植對半夏的灰分影響不大。為了進一步分析野生和栽培息半夏總灰分的差異，利用Simca軟件對野生和栽培息半夏總灰分歸一化后的數(shù)據(jù)進行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的主成分分析模型（PCA模型，PCA－X）（見圖3）。PCA得分圖中每個點代表一個息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，不同地區(qū)的野生和栽培息半夏樣品特征接近，并無明顯分類。

圖3 野生和栽培息半夏總灰分成分PCA圖

2.3 浸出物的測定（冷浸法）分別取粉碎過二號篩混合均勻的供試品約4.0 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶，精密加純化水100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時時振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取濾液20 mL，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量（%）。結(jié)果見表3，圖4。

表3 野生和栽培息半夏浸出物檢測結(jié)果 （%）

圖4 野生和栽培息半夏浸出物檢測結(jié)果圖

野生和栽培息半夏浸出物含量隨生長周期逐漸增加，其變化趨勢基本保持一致，其中，栽培息半夏浸出物含量略微高于野生息半夏。為了進一步分析野生和栽培息半夏浸出物含量的差異，通過Simca軟件對野生和栽培息半夏浸出物含量歸一化后的數(shù)據(jù)進行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖5）。PCA得分圖中每個點代表一個息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，每個地區(qū)野生息半夏和栽培息半夏樣品各自聚為一類。

圖5 野生和栽培息半夏浸出物成分PCA圖

2.4 有機酸的測定分別取粉碎過四號篩混合均勻的供試品粉末5.0 g，精密稱定后置于錐形瓶中，加入體積分數(shù)95%乙醇（分析純）50 mL，加熱回流提取1 h，再重復(fù)提取2次，共提取3次。放冷之后進行過濾，將濾液合并后蒸干，殘渣精密加入氫氧化鈉滴定液（0.106 4 mol·L－1）10 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加新沸過的冷水定容并搖勻［2］。精密量取25 mL，用鹽酸滴定液（0.101 8 mol·L－1）按照電位滴定法滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1 mL氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）相當(dāng)于5.904 mg琥珀酸（C4H6O4）。結(jié)果見表4，圖6。

表4 野生和栽培息半夏有機酸含量測定結(jié)果 （%）

野生和栽培息半夏有機酸含量呈現(xiàn)“W”形變化趨勢，其中野生息半夏有機酸含量高于栽培息半夏有機酸含量。為了進一步分析野生和栽培息半夏有機酸含量的差異，通過Simca軟件對野生和栽培息半夏有機酸成分歸一化后的數(shù)據(jù)進行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖7）。PCA得分圖中每個點代表一個息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知，所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，野生息半夏和栽培息半夏樣品各自聚為一類。

圖6 野生和栽培息半夏有機酸含量圖

圖7 野生和栽培息半夏有機酸成分PCA圖

2.5 生物堿的測定

2.5.1 鹽酸麻黃堿對照品溶液的制備精密稱取5.456 mg鹽酸麻黃堿標準品，配制濃度為1.091 2 g·L－1的鹽酸麻黃堿標準溶液，用新沸過冷卻的純化水稀釋成濃度為0.103 6 g·L－1的對照品溶液，備用。

2.5.2 供試品溶液的制備與生物堿的測定采用熱浸法將0.5 g半夏粉末與0.5 mL、體積分數(shù)為25%氨水和5 mL三氯甲烷混合，在35～40℃水浴條件下提取1 h，將息半夏生物堿提取溶液以5 000 r·min－1進行離心操作5 min，取上清液［22］。將2 mL上清液、8 mL三氯甲烷、10 mL枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液（pH＝5.40）和1 mL體積分數(shù)0.1%溴麝香草酚藍溶液混合，振蕩1 min后，靜置1 h，于416 nm［23］波長下測定三氯甲烷層溶液吸光度。

2.5.3 標準曲線的制備準確移取鹽酸麻黃堿對照品溶液0.20 mL、0.35 mL、0.50 mL、0.65 mL、0.80 mL置于分液漏斗中，分別加純化水至1.0 mL。將10 mL pH5.40的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液、1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%溴百里酚藍溶液及10 mL三氯甲烷依次加入分液漏斗中；振蕩1 min后，靜置1 h。于416 nm波長下測量三氯甲烷層的吸收值。以鹽酸麻黃堿標準液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線，回歸方程為y＝0.014 21x＋0.017，r＝0.999 2，說明在0.020 72～0.082 88 g·L－1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.4 重復(fù)性考察隨機取長陵野生7月息半夏樣品，按供試品溶液制備方法平行處理6份，測定其吸光度，測得含量RSD值為1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性考察隨機取長陵野生7月息半夏樣品供試品溶液，按0 h、1 h、2 h、3 h、4 h測定吸光度，連續(xù)4 h，結(jié)果RSD值為2.3%，表明該供試品在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 精密度考察隨機取長陵野生7月息半夏樣品供試品溶液，平行操作6次測其吸光度，測得結(jié)果RSD值為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 加樣回收率實驗隨機取已知含量的樣品9份，每份0.25 g，分別置于錐形瓶中，精密加入一定量的鹽酸麻黃堿對照品，按2.5.2項下方法制備供試品溶液并測其吸光度，計算其加樣回收率，結(jié)果生物堿平均加樣回收率為97.81%，RSD值為0.56%。見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果

2.5.8 樣品含量測定樣品含量測定方法按2.5.2項下內(nèi)容。樣品含量結(jié)果見表6，圖8。

表6 野生和栽培息半夏生物堿含量測定結(jié)果 （%）

圖8 野生和栽培息半夏生物堿含量圖

野生和栽培息半夏生物堿含量在8月份略微下降后又持續(xù)增加，直至11月份時含量再次降低，其中野生息半夏生物堿含量高于栽培息半夏生物堿含量。為了進一步分析野生和栽培息半夏生物堿含量的差異，通過Simca軟件對野生和栽培息半夏生物堿成分歸一化后的數(shù)據(jù)進行降維分析，利用Outlier剔除異常樣本，建立無監(jiān)督的PCA模型（PCA－X）（見圖9）。PCA得分圖中每個點代表一個息半夏樣品，橢圓為95%置信區(qū)間。由結(jié)果可知所有樣品均位于可信區(qū)間內(nèi)，各地區(qū)野生和栽培息半夏均各自聚為一類。

圖9 野生和栽培息半夏生物堿成分PCA圖

2.6 野生息半夏及栽培息半夏主成分分析通過Simca（14.1）的PCA－X及SPSS（19.0）分析發(fā)現(xiàn)，野生息半夏和栽培息半夏的浸出物、生物堿、有機酸等成分具有差異性，為進一步探討野生及栽培息半夏的化學(xué)成分間的聯(lián)系，本研究利用主成分分析法進行分析，其主要是利用降維思想，將多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標的統(tǒng)計學(xué)方法。其目的之一主要是在盡可能減少損失的基礎(chǔ)上，得到幾個綜合因子代表原來的眾多變量［21］。因為息半夏是多組分的復(fù)合體，因此，采用主成分分析法對本實驗中測定的4類化學(xué)成分進行評價，綜合考察息半夏藥材的品質(zhì)特征。

將不同地區(qū)野生息半夏及栽培息半夏各成分含量數(shù)據(jù)分別進行標準化處理后，利用SPSS（19.0）對其進行分析。結(jié)合表7中的數(shù)據(jù)可知（野生息半夏）：第一主成分與浸出物、有機酸、生物堿的相關(guān)性較強，基本能夠代表野生息半夏中此3種化學(xué)組分的綜合水平，貢獻率為48.977%；第二主成分主要與生物堿、總灰分存在較強的相關(guān)性，貢獻率為36.385%，因此這兩個主成分基本反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可以體現(xiàn)野生息半夏藥效成分的整體水平。

結(jié)合表8中的數(shù)據(jù)可知（栽培息半夏）：第一主成分與浸出物、有機酸、生物堿的相關(guān)性較強，基本能夠代表栽培息半夏中此3種化學(xué)組分的綜合水平，貢獻率為43.869%；第二主成分主要與總灰分、生物堿存在較強的相關(guān)性，貢獻率為37.231%，因此這兩個主成分基本反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息，可以體現(xiàn)栽培息半夏藥效成分的整體水平。

表7 野生息半夏主成分載荷矩陣及解釋的總方差

表8 栽培息半夏主成分載荷矩陣及解釋的總方差

分別以F1和F2的貢獻率與兩者累計貢獻率的比值作為權(quán)數(shù)，并以F＝0.574F1＋0.426 F2求出綜合野生息半夏得分值，以F＝0.541F1＋0.459 F2求出綜合栽培息半夏得分值。由表9、表10結(jié)果可知，基于第一主成分和綜合主成分得分［21］：關(guān)店、陸灣栽培息半夏與三地區(qū)野生息半夏在浸出物、生物堿、有機酸化學(xué)組分含量接近，整體水平較高，說明關(guān)店、陸灣栽培息半夏作為野生息半夏替代品具備一定的合理性。

表9 各地區(qū)野生及栽培息半夏樣品主成分值、綜合主成分值

表10 各地區(qū)野生及栽培息半夏樣品主成分均值、綜合主成分得分均值

3 討論

通過對3個不同地區(qū)的野生息半夏及栽培息半夏各成分含量的分析，表明栽培息半夏的浸出物指標含量較野生息半夏高，野生息半夏總灰分指標低于栽培息半夏，但生物堿、有機酸含量高于栽培息半夏，這可能是因為野生息半夏在自然環(huán)境下，其生長時間長且緩慢，因此其次生代謝產(chǎn)物積累較為豐富，但栽培息半夏水肥條件優(yōu)越，土壤營養(yǎng)充足，在整個生長過程中，生物量增加較快，塊莖體積較大，次生代謝產(chǎn)物累積卻相對較少［16］。

基于此，利用Simca PCA－X分析發(fā)現(xiàn)野生息半夏總灰分、浸出物等指標特征與栽培息半夏并無顯著區(qū)分，而野生息半夏的生物堿及有機酸指標和栽培息半夏能夠明顯區(qū)分，在PCA－X模型中各自聚為一類，生物堿類［17］、有機酸［2］類成分是息半夏的主要藥用成分之一，但目前由于野生資源匱乏，為了響應(yīng)國家保護野生種質(zhì)資源的號召，息半夏道地產(chǎn)區(qū)的農(nóng)戶不得不對息半夏進行人工繁育。通過對各地區(qū)野生息半夏及栽培息半夏主成分及綜合主成分質(zhì)量評價得分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培息半夏作為野生息半夏替代品具備一定的合理性。

另外，由于本研究中所采用的息半夏樣品僅為信陽市息縣的部分地區(qū)野生及栽培品息半夏，并未完全涵蓋所有息半夏的樣品信息，因此，后期將擴大樣品范圍，并利用LC－MS、GC－MS等儀器對野生及栽培息半夏的其他有效成分進行相關(guān)分析，并對野生息半夏及栽培息半夏的藥理作用進行全面系統(tǒng)地對比研究，以期對野生息半夏及栽培息半夏有更全面的了解。