陳 爽，陳懷鵬，王蓬琨，趙 魁，賀文琦，宋德光，關繼羽

(吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

水皰性口炎(vesicular stomatitis，VS)是由水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)感染引起的豬、馬、牛等多種哺乳動物和人共患的急性高度接觸性傳染病，被我國列為《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中重點防范的13種外來動物疫病之一。雖然VSV感染很少直接導致患畜死亡，但由此引發(fā)的動物機體抵抗力下降、繼發(fā)性感染和群體性傳播也曾給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。VSV屬于彈狀病毒科、水皰病毒屬，其基因組是不分節(jié)段的單股負鏈RNA。VSV通過節(jié)肢動物作為傳播媒介感染家畜和嚙齒類動物，也可感染人類[1]。VSV基因組從3′到5′端依次編碼5個蛋白(N、P、M、G、L蛋白)。其中，N、P、L蛋白可以協(xié)同某些宿主蛋白形成RNA依賴的RNA聚合酶，從而有效行使病毒轉錄功能。N蛋白在病毒復制過程中還可以結合新生的病毒RNA，阻止雙鏈RNA(dsRNA)中間體的形成，從而避免被宿主細胞內RNA傳感器介導的先天免疫應答反應所識別[2]。不僅如此，N、M蛋白可通過降低宿主細胞的其他抗病毒反應進行免疫逃逸[3-6]。據(jù)報道，M蛋白也可通過抑制宿主基因mRNA的核-質運輸進程，在整體上抑制宿主基因的表達水平[7]。

宿主細胞可以利用多種機制對抗入侵的病毒[8]。VSV亦可借助多種宿主因子來抵抗、逃避宿主細胞的應答反應，實現(xiàn)復制增殖[9]。已有研究表明，宿主因子干擾素(IFN)誘導蛋白35(IFI35)在VSV感染過程中對IFN的抗病毒反應具有負向調控作用，其可通過抑制視黃酸誘導的基因I(RIG-I)的激活，削弱其作為RNA傳感器在細胞抗病毒反應中的重要作用，抑制IFN的產(chǎn)生，進而促進VSV復制。干擾素誘導蛋白44(IFI44)是另一種IFN誘導產(chǎn)生的蛋白，其表達水平可被IFN-α、IFN-β所誘導，但不可被IFN-γ誘導[10]。還有研究報道IFI44因子參與慶大霉素誘導的耳毒性和腎毒性相關的炎癥反應進程[11]。IFI44在各種病毒感染過程中展現(xiàn)的作用因病毒種類不同而有所差異。IFI44可通過抑制人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的LTR 啟動子的活性從而影響病毒轉錄[12]。當髓系來源細胞HAP-1感染Ⅰ型甲流病毒(IAV)時，IFI44與細胞因子FK506結合蛋白5(FKBP5)發(fā)生相互作用，負調控宿主細胞的抗病毒應答，進而促進病毒復制[13]。此外，IFI44還參與了如腫瘤細胞增殖及抗輻射效應等多種生物學進程。

本試驗通過構建IFI44基因沉默和過表達載體、包裝慢病毒、分別建立IFI44沉默及過表達細胞系，探討宿主因子IFI44對VSV復制增殖的影響。本研究不僅為揭示VSV 的致病機理奠定基礎，也為探索VS的疫病防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒小鼠巨噬細胞系RAW264.7、293T細胞及VSV均由本實驗室保存。

1.2 試劑EasyGeno快速重組克隆試劑盒、無內毒素質粒大量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自天根公司；限制性內切酶KpnⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；嘌呤霉素、DMEM培養(yǎng)液及雙抗購自美侖公司；血清購自Gibco公司；轉染試劑LipoFiter 3.0購自漢恒公司。

1.3 IFI44基因沉默慢病毒載體的設計和構建參照GenBank數(shù)據(jù)庫中的鼠源IFI44的基因序列(登錄號：NM_133871.3)，利用在線軟件http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/設計2條靶向該基因的shRNA序列。將用于合成shRNA的2對引物稀釋為10 μmol/L后各取2 μL，再加入2 μL的T4DNA連接酶(10 ×)、1 μL T4PNK及ddH2O補足至20 μL體系，瞬時離心混合后置于37℃水浴30～40 min，95℃煮沸5 min，自然降溫至室溫，形成雙鏈Oligo。同時，用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對空載體 pLVX-shRNA-Puro進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回收線性化的載體片段。將上述退火形成的Oligo與線性化載體片段進行連接、轉化、涂板，挑取單克隆進行質粒大量提取制備。

1.4 IFI44基因過表達慢病毒載體的設計和構建按照EasyGeno Primer無縫克隆在線設計原則，以同源重組的方式構建重組質粒，依據(jù)IFI44的基因編碼序列以及空載體pLVX-IRES-Puro的多克隆位點區(qū)設計引物。以合成的10 μmol/L引物、PrimerStar Max預混液、來自于RAW264.7細胞的cDNA為模板擴增IFI44基因編碼區(qū)序列(攜帶質粒同源臂)，與經(jīng)酶切線性化的載體片段按一定比例混合，加入5 μL的2×Easy Geno Assembly Mix，用ddH2O補足至10 μL后，將混合反應液置于50℃水浴孵育15 min。隨后進行瞬時離心，并將離心管置于冰上冷卻5 min獲得連接產(chǎn)物。連接產(chǎn)物進行轉化、挑菌、搖菌，測序驗證。對驗證正確的菌液進行無內毒素質粒大量提取。

1.5 慢病毒顆粒包裝將處于DMEM完全營養(yǎng)液(10%血清+1%雙抗)中的293T細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合度為60%～70%時轉染細胞。將漢恒脂質體LipoFiter 3.0加入250 μL的OPTI-MEM營養(yǎng)液中混勻，加入250 μL 用于慢病毒包裝的穿梭及骨架質粒，各質粒的比例分別是穿梭質?！胮spAX2∶pMD2G為4∶4∶1。將上述脂質體試劑和質粒混勻后室溫孵育20 min，緩慢加入到生長于6孔板中的293T細胞中，并將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收取慢病毒上清備用。

1.6 IFI44基因沉默及過表達細胞系構建用收集的病毒液(MOI=10)感染RAW264.7細胞，靜置培養(yǎng)細胞72 h，觀察細胞狀態(tài)，換成含3 mg/L嘌呤霉素、2%血清的DMEM完全營養(yǎng)液進行陽性細胞篩選，每2 d換1次含嘌呤霉素的培養(yǎng)液，直至最終得到具有嘌呤霉素抗性的基因修飾細胞系。

1.7 VSV感染基因修飾細胞系將IFI44基因沉默/過表達細胞系及其相應對照細胞培養(yǎng)至細胞匯合度為85%時接種VSV(MOI=1)，8 h后收集上清液進行病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)測定，同時將細胞裂解提取細胞總RNA、反轉錄成cDNA，并利用實時熒光定量 PCR 以 VSV的P基因及反向基因組引物序列進行分析[8]。

2 結果

2.1 設計、構建重組IFI44基因沉默、過表達質粒IFI44基因沉默質粒設計如圖1A所示，從GenBank獲取鼠源IFI44的基因序列，利用在線軟件設計2條靶向該基因的shRNA序列。分別添加BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點于上、下游引物末端，引物序列如表1所示。將經(jīng)退火形成的雙鏈Oligo與線性化穿梭載體pLVX-shRNA-Puro(經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切)進行連接、轉化。IFI44基因過表達質粒設計如圖1B所示。通過EasyGeno無縫克隆在線軟件設計擴增IFI44基因的引物序列(表2)。提取小鼠巨噬細胞系總RNA后反轉錄成cDNA，再以此為模板通過PCR法擴增得到IFI44編碼區(qū)全長片段，此目的片段攜帶靶向載體的同源序列。將該產(chǎn)物回收純化后以同源重組的形式插入靶向慢病毒載體pLVX-IRES-Puro中。經(jīng)菌液PCR及測序測定后大量提取擴增，獲得重組質粒。

A.IFI44沉默載體;B.IFI44過表達載體

表1 IFI44的 shRNA引物

表2 IFI44的基因擴增引物

2.2 慢病毒包裝、細胞感染及篩選鑒定以上述構建的IFI44基因沉默載體和過表達載體作為穿梭質粒與慢病毒骨架質粒pspAX2及pMD2G共同轉染293T細胞，轉染比例為4∶4∶1。轉染細胞72 h后收集含病毒液的細胞上清，感染小鼠巨噬細胞系RAW264.7，病毒感染48 h后以3 mg/L嘌呤霉素進行篩選，同時設置空載病毒進行感染、篩選，作為對照。將經(jīng)嘌呤霉素篩選后的上述細胞分別裂解、提取總RNA、反轉錄cDNA、進行qPCR檢測。結果顯示，2個shIFI44慢病毒感染組的IFI44基因轉錄水平顯著降低，表明成功構建IFI44基因沉默細胞系(圖2)。依照上述試驗方案，包裝攜帶IFI44基因的慢病毒顆粒，并對RAW264.7進行感染、篩選，獲得具有抗性的細胞系。對細胞進行裂解、RNA提取、cDNA合成及qPCR檢測。結果顯示，IFI44的轉錄水平顯著上調，表明成功構建IFI44 基因過表達細胞系(圖3)。

***示P<0.001

****示P<0.000 1

2.3 IFI44基因沉默對VSV復制增殖的影響將上述篩選獲得的IFI44沉默細胞系及相應空載體對照細胞系感染VSV(MOI=1)10 h后收集細胞。裂解、提取細胞總 RNA，隨后反轉錄成 cDNA 并進行 Real-time PCR 檢測。與對照組細胞相比發(fā)現(xiàn)，VSV-P蛋白的mRNA水平顯著下降，表明病毒的轉錄進程受到抑制(圖4A)。不僅如此，IFI44基因沉默也使得VSV的反向基因組水平被顯著削弱，表明VSV的復制增殖受到抑制(圖4B)。此外，TCID50測定試驗也證實了IFI44基因沉默的抗病毒效果(圖4C)。

A.VSV-P mRNA水平；B.VSV反向基因組水平；C.TCID50。***示P<0.001

2.4 IFI44基因過表達對VSV復制增殖的影響將上述篩選獲得的IFI44基因過表達細胞系及相應空載體對照細胞系感染VSV(MOI=1)10 h后收集細胞，裂解細胞、提取細胞總RNA、反轉錄成cDNA并進行熒光定量PCR法檢測。經(jīng)與對照組細胞比較發(fā)現(xiàn)，IFI44過表達顯著上調VSV-P的基因轉錄水平，表明此時病毒轉錄進程受到促進(圖5A)。同時，IFI44過表達也會顯著提高VSV的反向基因組水平，表明促進了VSV的復制增殖(圖5B)。此外，TCID50測定試驗也證實了IFI44基因過表達的促病毒效果(圖5C)。

A.VSV-P mRNA水平；B.VSV反向基因組水平；C.TCID50。*示P<0.05；****示P<0.000 1

3 討論

近年來，非洲豬瘟和小反芻獸疫等外來疫病的傳入給我國家畜養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟損失。因此，加強對尚未傳入我國的外來疫病的防控、增強相關理論及技術研究儲備，對于家畜生產(chǎn)安全、食品供應安全至關重要。VS是一種可感染多種家畜動物和人的急性、高度接觸性傳染病，是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中重點防范的13種外來動物疫病之一。VS的發(fā)病由VSV感染引起，雖然患畜因VSV感染直接導致死亡的情況較少，但由此引發(fā)的其他病原繼發(fā)性感染仍然會給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。VSV的自然宿主包括牛、豬、馬等動物，VSV感染人的案例也偶有報道，感染者常常出現(xiàn)輕度流感樣癥狀，而重癥患者則具有腦炎癥狀[14-15]。

作為一種具有廣泛細胞嗜性的病毒，VSV侵入細胞時被宿主模式識別受體識別，進而誘導宿主細胞產(chǎn)生IFN及其相關因子[16-17]。宿主細胞內IFN的產(chǎn)生對機體抵抗病毒、限制病毒復制及清除病毒的進程中至關重要[18]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，某些IFN誘導蛋白并未起到抗病毒作用。例如，IFI35對宿主細胞的抗病毒應答反應可以起到負向調控的作用，而這一調節(jié)作用可作為宿主炎性反應的穩(wěn)態(tài)調控機制，以維持細胞內促炎-抗炎水平的平衡[8]。由IFN誘導的IFI44可參與多種病理生理進程，如對病毒的應答反應、參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病、對輻射的抵抗及調控腫瘤生長的特性[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，表達在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中的IFI44因子可以被長非編碼RNA(lncRNA)LINC01116所靶向抑制，在腫瘤對吉非替尼的耐藥進程中起到關鍵作用[19]。此外，作為IFI44的旁系同源基因，IFI44L被發(fā)現(xiàn)具有負向調節(jié)IFN先天免疫反應的作用。IFI44L基因沉默可限制病毒的復制，這有助于調節(jié)、限制由病毒誘導產(chǎn)生的炎癥反應[20]。然而，IFI44在VSV感染巨噬細胞后的具體作用尚有待研究。

為明確宿主因子IFI44在VSV復制增殖過程中的作用，本試驗首先包裝攜帶IFI44基因靶向shRNA的慢病毒以及攜帶IFI44基因編碼區(qū)的慢病毒，隨后感染RAW264.7細胞，并建立IFI44基因沉默及過表達細胞系。通過RT-qPCR方法對基因修飾結果進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)宿主因子IFI44可促進病毒的復制增殖。然而，目前尚不明確VSV復制增殖過程中的哪些進程受IFI44的調控。探究IFI44在宿主細胞內的促病毒作用規(guī)律則有待于深入探索。