葛 葉，周惠英，麥文鴻，岑曉峰，姚秋成，趙志輝

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

流感病毒根據(jù)NP蛋白的差異，分為A、B、C型。其中以A型流感病毒(AIV)影響范圍最廣，給人類和家禽帶來(lái)的威脅最大。A型AIV根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的差異分為18個(gè)HA亞型和11個(gè)NA亞型[1]。自1966年在北美的火雞中分離到第1株H9N2后，該亞型AIV已在全球范圍內(nèi)廣泛存在。隨著H9N2亞型 AIVs的進(jìn)化變異，目前主要分為歐亞分支和北美分支，其中歐亞分支進(jìn)一步細(xì)化為A/chicken/Beijing/1/94(BJ94-like)(也有稱為Y280-like或者G9-like)、A/quail/Hong Kong/G1/1997(G1-like)和A/chicken/Hong Kong/Y439/1997(Y439-like)三大亞分支，而G1分支又進(jìn)一步分為G1-W和G1-E分支。BJ94分支目前主要流行于印度尼西亞、日本和緬甸等地，中國(guó)主要流行BJ94和G1-E兩大分支,Y439分支主要流行于韓國(guó)，G1-W分支主要流行于非洲北部的利比亞、阿爾及利亞、埃及以及亞洲的西南部沙特阿拉伯、伊拉克、伊朗等國(guó)家[2-3]。

H9N2亞型 AIV的宿主范圍很廣，不僅能夠感染不同種類的家禽(雞、鴨、鵝)、野鳥(niǎo)，還具備不通過(guò)中間宿主跨越種間障礙，直接感染哺乳動(dòng)物甚至感染人的能力[4]。1998年，從豬體內(nèi)分離到H9N2 AIV，同期發(fā)生人感染H9N2事件[5]。針對(duì)與活禽接觸頻繁的工作人員的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)陽(yáng)性者的比率很高。另外，該亞型可在犬、鯨和水貂中檢測(cè)到[6]。而作為內(nèi)部基因復(fù)雜的供體作用尤為令人關(guān)注，該亞型AIV不僅是1997年中國(guó)香港H5N1高致病性AIV的內(nèi)部基因的供體[7]，而且還為新的人H7N9、H10N8 和H5N6 AIV提供了內(nèi)部基因[5,7-8]。近些年分離到的H9N2亞型AIV的HA基因的226和228位點(diǎn)大多為人源受體結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述，H9N2 AIV影響巨大，必須進(jìn)行系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)。

為掌握廣東省雷州半島水禽體內(nèi)的H9N2亞型AIV的攜帶情況，本研究于2019年從廣東省雷州半島的4個(gè)不同方位的具有代表性的5個(gè)大型鴨場(chǎng)開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查，了解家養(yǎng)水禽H9N2亞型AIV的攜帶情況。通過(guò)遺傳演化分析和從分子水平的角度闡述H9N2亞型AIV的潛在危害，為家禽的防控預(yù)警提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾公司；SPF雞胚購(gòu)自廣東大華農(nóng)有限公司；Easy Taq DNA 聚合酶和膠回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.2 病毒的分離鑒定與測(cè)序2019年春、秋兩季，于廣東省雷州半島東、西、南、北5個(gè)大型養(yǎng)殖戶采集咽拭子和喉拭子，共計(jì)568份。將拭子經(jīng)渦旋振蕩后，12 000 r/min離心5 min；取上清，用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌并接種于11日齡SPF雞胚中，37℃培養(yǎng)72 h。在此期間，每12 h照胚1次并棄掉死胚。無(wú)菌收獲尿囊液，經(jīng)HA試驗(yàn)初次判定，并利用特異性鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)一步確定病毒的種類及亞型。

利用TRIzol試劑提取尿囊液中病毒的RNA。利用U12通用引物及反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用AIV的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行常規(guī)的表面基因和內(nèi)部基因的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)后；72℃延伸7 min，4℃保存。按照全式金膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)回收擴(kuò)增的目的基因并測(cè)序。

1.3 遺傳演化分析利用DNAStar軟件的SeqMan模塊進(jìn)行序列編輯，通過(guò)NCBI和GISAID網(wǎng)站下載經(jīng)典毒株序列(包括歐亞分支的經(jīng)典毒株和北美分支的經(jīng)典毒株)，使用MEGA 6.0 的Clustal X 1.81軟件的最大相鄰法進(jìn)行序列處理并比對(duì)1 000 次進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制[9]。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定經(jīng)過(guò)雞胚接種后，HA和HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，從568份糞便拭子中共分離到3株H9N2亞型AIV，分別命名為A/duck/Guangdong/ZJ3-1/2019(H9N2)(簡(jiǎn)稱GD/ZJ3-1)、A/duck/Guangdong/F2/2019(H9N2) (簡(jiǎn)稱GD/F2)和A/duck/Guangdong/ML14/2019(H9N2) (簡(jiǎn)稱GD/ML14)。

2.2 病毒表面基因的遺傳演化分析通過(guò)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，這3株病毒的HA基因均屬于歐亞分支的Y280-like亞群，提示野鳥(niǎo)中的H9N2 AIV在我國(guó)經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程。3株病毒的HA基因核苷酸同源性為93.4%～99.9%，氨基酸同源性為93.9%～99.5%，分屬2個(gè)組(圖1A)。NCBI和GISAID流感數(shù)據(jù)庫(kù)中與GD/ZJ3-1的HA基因同源最高的是(A/chicken/Jiangsu/J2245/2018(H9N2)，與GD/F2同源性最高的是A/chicken/Shanghai/S1177/2018(H9N2)，與GD/ML14同源性最高的是A/chicken/Jiangsu/J2308/2018(H9N2)。NA基因比較發(fā)現(xiàn)，GD/ZJ3-1和GD/ML14的NA基因均與A/chicken/Nantong/02/2017(H9N2)的同源性最高，與GD/F2同源性最高的是A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL34/2018(H9N2)，3株病毒的NA基因處于同一個(gè)組(圖1B)(表1)。

A.HA基因;B.NA基因。The sequences of viruses listed in black were downloaded from available databases;viruses listed in everycolor were sequenced in this study.Abbreviations:CK.chicken;DK.duck;GS.goose;SW.swine;WDK.wild duck;EN.environment。下同

2.3 病毒內(nèi)部基因的遺傳演化分析早期的進(jìn)化研究表明，由于長(zhǎng)期地理隔離，AIV已逐漸演化為歐亞和北美兩個(gè)大分支。東西半球的AIV分別處于兩個(gè)不同的分支，基因重組或/和交換的情況非常有限，但該現(xiàn)象的發(fā)生也進(jìn)一步證明了候鳥(niǎo)的遷徙對(duì)AIV的重組與傳播的重要作用。本研究分離的3株病毒的8個(gè)基因均處于歐亞分支。3株H9N2 AIV的PB2基因同源性為96.5%～99.9%，氨基酸同源性為98.0%～99.7%處于1個(gè)組中(圖2A)；PB1基因的核苷酸同源性為96.7%～100.0%，氨基酸同源性為92.6%%～99.9%(圖2B)；PA基因的核苷酸同源性為96.2%～99.9%，氨基酸同源性為99.0%～99.9%(圖2C)；NP基因的核苷酸同源性為96.0%～99.9%，氨基酸同源性為99.2%～99.8%(圖2D)；M基因的核苷酸同源性為97.8%～100.0%，氨基酸同源性為96.0%～99.4%(圖2E)；NS基因共分為兩個(gè)大分支，Allele A和Allele B。Allele A為北美分支，Allele B為歐亞分支。本研究分離的3株病毒的NS基因均屬于歐亞分支。NS基因的核苷酸同源性為86.9%～98.1%，氨基酸同源性為79.1%～97.9%，分屬2個(gè)不同的組(圖2F)。從內(nèi)部基因的比較分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)分離的3株病毒均存在不同程度的重組現(xiàn)象。GD/ZJ3-1和GD/ML14為雞-人的重組病毒，而GD/F2為雞-鴨-野鳥(niǎo)-人的多重重組病毒。GD/ML14和GD/F2的M基因均與人的A/Beijing/1/2017(H9N2)株同源性最高(表1)。

表1 3株H9N2 AIV與NCBI中同源性最高的毒株

A.PB2;B.PB1;C.PA;D.NP;E.M;F.NS

2.4 生物學(xué)特性評(píng)價(jià)為進(jìn)一步了解野鳥(niǎo)源H9N2亞型AIV的潛在威脅，我們分析了3株病毒表面蛋白和內(nèi)部蛋白的分子標(biāo)記。3株病毒的HA堿性裂解位點(diǎn)為RSSR/GLF，無(wú)連續(xù)的多個(gè)堿性氨基酸，提示這3株病毒為低致病性AIV[1,6]。受體結(jié)合位點(diǎn)顯示3株病毒均為226L 和228G，也就是說(shuō)226位點(diǎn)發(fā)生由偏嗜禽源受體向偏嗜人源受體的改變[4,10]。值得注意的是，本研究分離的3株病毒的NA基因長(zhǎng)均為1 402 bp，編碼467個(gè)氨基酸，存在著頸部缺失，意味著該3株病毒對(duì)小鼠的致病力增強(qiáng)[11]。PB2的Q591K、E627K或D701N位點(diǎn)突變意味著病毒的聚合酶活性和病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的復(fù)制能力增強(qiáng)[12]，本試驗(yàn)的3個(gè)病毒株不存在上述3個(gè)改變。然而，這3個(gè)分離株的PB2蛋白發(fā)生了I292V的突變，意味著3株病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后聚合酶的活性增強(qiáng)，并對(duì)小鼠的致病力增強(qiáng)[13]。PB2的588V是H10N8、H7N9和H9N2亞型適應(yīng)哺乳動(dòng)物的標(biāo)志。本研究的3個(gè)分離株均存在588V的特征[14]。本研究的3株AIVs的PB1蛋白上436位均為酪氨酸。PA蛋白的515位為蘇氨酸，呈現(xiàn)對(duì)家禽和哺乳動(dòng)物的低致病性的特征[15]。PB1-F2蛋白的66位N-S的變化提示1918年AIV分離株和高致病性H5N1亞型AIV對(duì)小鼠和雪貂的致病力增強(qiáng)[14-17]。本研究的3株AIV的PB1-F2蛋白上66位均為絲氨酸，提示這些病毒可能存在著對(duì)小鼠致病性增強(qiáng)的情況。本研究中的3株病毒出現(xiàn)了M1蛋白的N30D和T215A的氨基酸變化、M2蛋白S31N變化，意味著病毒對(duì)金剛烷胺的耐藥性增強(qiáng),說(shuō)明AIV隨著病毒的遺傳進(jìn)化重組，出現(xiàn)抵抗金剛烷胺類藥物的特性[15]。NS1蛋白的42位發(fā)生P42S的變化，病毒的毒力有增強(qiáng)的趨勢(shì)[18-19]，詳見(jiàn)表2。

表2 病毒基因節(jié)段的分子標(biāo)記

3 討論

H9N2亞型AIV廣泛分布于世界各國(guó)，但主要在亞洲的家禽中流行，是我國(guó)家禽中流行最為廣泛的AIV之一。H9N2亞型AIV在家禽中穩(wěn)定存在和持續(xù)流行不僅給家禽飼養(yǎng)業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，而且對(duì)人類健康構(gòu)成了日益嚴(yán)重的威脅。H9N2亞型AIV作為供體基因的危害也很大，如人的H7N9和H10N8亞型AIV。正是由于H9N2亞型AIV在我國(guó)家禽中廣泛且穩(wěn)定存在，所以該亞型的AIV不容忽視。

雷州半島位于我國(guó)廣東省境內(nèi)，是中國(guó)大陸的最南端，地處熱帶和亞熱帶的交界處，是全球鳥(niǎo)類的8條遷徙路線中的1條，也是眾多候鳥(niǎo)的越冬地。雷州半島家養(yǎng)水禽的飼養(yǎng)量龐大，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，家養(yǎng)水禽飼養(yǎng)場(chǎng)常處于水庫(kù)旁，水禽可自由游走于水庫(kù)內(nèi)，常形成候鳥(niǎo)和家禽混居的情況。本研究選擇雷州半島東、西、南、北4個(gè)方向的代表性的大型養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣品，獲得 3株H9N2亞型AIV。全基因測(cè)序及遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，這3株H9N2 AIV的HA基因和NA基因都屬于歐亞分支的Y280亞分支。6個(gè)內(nèi)部基因同屬于歐亞分支。更重要的是，這3株病毒存在不同情況的重組現(xiàn)象為三重重組和五重重組的病毒。重組不僅發(fā)生在家禽和野鳥(niǎo)之間，亦發(fā)生在野鳥(niǎo)、家禽和人之間。推測(cè)可能是由于飼養(yǎng)環(huán)境所致如此復(fù)雜的重組現(xiàn)象。

從基因的分子水平分析發(fā)現(xiàn)，本研究3株病毒的HA蛋白出現(xiàn)Q226L的變異，意味著由偏嗜禽源受體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)至偏向人源的受體結(jié)合位點(diǎn)。該現(xiàn)象也存在于近幾年分離到的H9N2亞型AIV，意味著H9N2亞型AIV的感染性更易感人類和哺乳動(dòng)物。這3株病毒出現(xiàn)M1蛋白N30D和T215A的氨基酸變化，此結(jié)果與目前流行毒株的分析結(jié)果相吻合。目前流行的AIV大多數(shù)M1蛋白出現(xiàn)這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變化，同時(shí)NS1蛋白的42位同樣發(fā)生著P42S的變化，說(shuō)明隨著時(shí)間的推移，病毒的毒力有增強(qiáng)的趨勢(shì)，這也意味著病毒的變異向著毒力更強(qiáng)的方向轉(zhuǎn)變。3株H9N2亞型AIV分離株中的2株，GD/ML14和GD/F2的M基因來(lái)源于人的H9N2亞型AIV。這也是首次從鴨體內(nèi)分離到如此重組多樣的病毒，這樣新的重組病毒可能對(duì)家禽乃至人類的健康存在著潛在的威脅。本研究進(jìn)一步證實(shí)了H9N2亞型AIV的內(nèi)部基因在病毒的重組中發(fā)揮著重要作用。