王 爽，任 捷，郭行健，劉祿情，張冰冰，趙瑩瑩，麻芯茹，李 銘，徐 闖*，楊 威*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

近年來，隨著我國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，奶牛泌乳性能不斷提高，奶牛相關(guān)營(yíng)養(yǎng)代謝類疾病的發(fā)病率也持續(xù)增長(zhǎng)，酮病是高產(chǎn)奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝類疾病中最常見的一種。酮病多發(fā)于奶牛圍產(chǎn)期，臨床上常出現(xiàn)低血糖、高酮血、酮尿、酮乳，消化功能紊亂，產(chǎn)奶量下降，體質(zhì)量減輕等癥狀,個(gè)別奶牛甚至可能出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，且增大患其他圍產(chǎn)期疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

奶牛酮病的發(fā)生與能量負(fù)平衡(NEB)及體脂動(dòng)員有關(guān)，常于妊娠期最后2周和泌乳早期(產(chǎn)后0～70 d) 發(fā)病[2]。當(dāng)奶牛發(fā)生能量代謝負(fù)平衡時(shí)，會(huì)引起血液中葡萄糖含量的降低，體脂開始動(dòng)員，產(chǎn)生大量的非酯化脂肪酸(NEFAs)，經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，而當(dāng)肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量的NEFAs時(shí)，超出肝臟的氧化分解能力，則會(huì)進(jìn)行不完全β-氧化，產(chǎn)生β-羥丁酸(BHBA)、丙酮、乙酰乙酸等酮體在體內(nèi)大量堆積，最終引發(fā)酮病[3]。同時(shí)在肝臟吸收過量的游離脂肪酸后，線粒體對(duì)其氧化的能力不足，就會(huì)增加肝細(xì)胞中甘油酸三酯(TAG)的合成，高爾基體內(nèi)載脂蛋白B(ApoB)與TAG結(jié)合，形成極低密度脂蛋白(VLDL)并以VLDL顆粒的形式向肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液中循環(huán)利用。

VLDL是內(nèi)源性TAG由肝臟向肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)的主要形式，其合成和分泌是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)密調(diào)控的過程，對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)起重要作用。VLDL主要由TAG、膽固醇、膽固醇酯(TC)、磷脂(PL)及ApoB100、載脂蛋白AⅠ(ApoA Ⅰ)、載脂蛋白A Ⅳ(ApoA Ⅳ)、載脂蛋白C(ApoC)及載脂蛋白E(ApoE)等脂蛋白質(zhì)構(gòu)成[4]。肝臟VLDL合成過程分為兩步，首先微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)催化部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的TAG使其轉(zhuǎn)移到粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上發(fā)生易位的新生ApoB100上，在此過程中，新生ApoB100被部分脂化從而形成一個(gè)低脂的原始VLDL顆粒，在第二步中，原始VLDL出芽易位于平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體腔與富含TAG的脂質(zhì)小滴以及PL、TC及游離膽固醇結(jié)合，進(jìn)而最終形成可以向肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)的成熟VLDL顆粒[5]。

研究顯示NEB所致的酮病奶牛存在肝臟VLDL的組裝原料不足，VLDL合成分泌障礙，最終導(dǎo)致奶牛酮病的發(fā)生，而其致病機(jī)制目前尚不清晰。本試驗(yàn)旨在明確酮病奶牛血液VLDL組成特征，為深入探究圍產(chǎn)期酮病奶牛肝臟VLDL合成和分泌失衡機(jī)制提供理論依據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本試驗(yàn)在黑龍江省某千頭集約化奶牛場(chǎng)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)?zāi)膛＞鶠樽杂膳P欄飼養(yǎng)，采食全混合日糧(TMR)。根據(jù)體況、年齡及胎次相近原則，隨機(jī)選取產(chǎn)后7～14 d奶牛，檢測(cè)其血液中酮體含量以及根據(jù)臨床癥狀選取健康奶牛(BHBA<1.2 mmol/L)、臨床型酮癥奶牛(BHBA≥3.0 mmol/L)各6頭作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在清晨奶牛進(jìn)食前，尾靜脈采集30 mL血液備用。

1.2 VLDL顆粒分離血液樣品室溫下靜止2 h，以2 000 r/min離心20 min，取血清加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)至1%，用1.006 kg/L的NaCl + NaBr溶液2 mL覆蓋6 mL的血清，60 000×g離心30 min以從血清中去除乳糜微粒(CM)。再加入1.006 kg/L 的NaCl + NaBr溶液至8 mL，10℃、70 000 r/min 離心18 h分離VLDL。

1.3 VLDL顆粒負(fù)染色及顆粒特征觀察通過超速離心分離得到的VLDL顆粒用PBS稀釋后滴到經(jīng)過輝光放電的銅網(wǎng)上，使其在銅網(wǎng)上停留1 min，該過程在冰上操作。然后將銅網(wǎng)用3滴去離子水快速清洗，每次清洗前后用濾紙將多余液體吸除。再滴加3滴甲酸雙氧鈾對(duì)銅網(wǎng)進(jìn)行快速染色，每次染色前后用濾紙將多余液體吸除，最后1次滴加甲酸雙氧鈾要求其在銅網(wǎng)上停留5 min后吸除，甲酸雙氧鈾同樣置于冰基底上以保持低溫并遮光。染色后的銅網(wǎng)用濾紙從背面將多余液體吸除干凈，于常溫下自然風(fēng)干后通過透射電鏡觀察VLDL顆粒特征情況。

1.4 VLDL-ApoB含量測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)分組要求，按照1.1方法獲取血清，按試劑盒說明書步驟測(cè)定不同疾病狀態(tài)下奶牛血液中VLDL-ApoB的含量。

1.5 VLDL顆粒組成中PL、TC含量測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)分組要求，分別采集不同疾病狀態(tài)下的奶牛血液超速離心得到VLDL顆粒，按照 ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)健康奶牛、亞臨床酮病奶牛及酮病奶牛VLDL的主要組成成分中PL、TC的含量變化情況并比較。

1.6 VLDL顆粒代謝組學(xué)特征研究按照1.2方法獲得不同疾病狀態(tài)下奶牛血液VLDL顆粒，利用LC-MS組學(xué)技術(shù)對(duì)奶牛血液VLDL顆粒進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，分析比較其主要差異脂質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 奶牛血液VLDL-ApoB含量檢測(cè)對(duì)不同疾病狀態(tài)下奶牛血液VLDL-ApoB含量測(cè)定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，奶牛血液中VLDL-ApoB的含量隨奶牛酮病的發(fā)病程度呈趨勢(shì)性降低，且臨床型酮病奶牛血液中VLDL-ApoB的含量顯著低于健康對(duì)照組。

2.2 奶牛血液VLDL顆粒大小觀察對(duì)不同疾病狀態(tài)下奶牛血液VLDL顆粒特征觀察結(jié)果顯示，臨床型酮病奶牛血液中VLDL顆粒均較大于健康奶牛，且臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒中較大顆粒占據(jù)較大比例(圖2)。

注：*.與健康對(duì)照組相比差異顯著 (P<0.05);**.與健康對(duì)照組相比差異極顯著 (P<0.01) 。下同

圖2 健康(左)及臨床型酮病(右)奶牛VLDL顆粒特征

2.3 奶牛血液VLDL顆粒組成中PL、TC含量測(cè)定對(duì)不同疾病狀態(tài)下奶牛血液VLDL顆粒組成中PL和TC含量測(cè)定結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，奶牛血液VLDL顆粒組成中PL的含量隨奶牛酮病發(fā)生程度呈趨勢(shì)性降低，臨床型酮病奶牛血液VLDL中PL含量顯著低于健康奶牛。而對(duì)照組、亞臨床型酮病組和臨床型酮病奶牛組中TC含量差異不顯著。

圖3 VLDL顆粒組成特征

2.4 奶牛血液VLDL顆粒代謝組學(xué)分析對(duì)健康對(duì)照組奶牛及臨床型酮病奶牛血液中VLDL顆粒代謝組學(xué)檢測(cè)及分析結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒中不同TAG相關(guān)脂質(zhì)與健康對(duì)照組無明顯差異，但磷脂相關(guān)脂質(zhì)如PE-NMe(22∶0/24∶1(15Z))、PE(22∶2(13Z)/24∶1(15Z))和PE (22∶5(4Z))均顯著或極顯著低于健康對(duì)照組。

圖4 奶牛血液VLDL顆粒代謝組學(xué)分析

3 討論

圍產(chǎn)期奶牛健康對(duì)整個(gè)泌乳周期都至關(guān)重要，是奶牛飼養(yǎng)管理中最具挑戰(zhàn)性的時(shí)期之一。圍產(chǎn)期奶牛由于經(jīng)歷妊娠-分娩-泌乳啟動(dòng)等生理應(yīng)激，以及低能飼喂到高能飼喂轉(zhuǎn)化的應(yīng)激，導(dǎo)致奶牛由于干物質(zhì)攝入減少但能量需求增加而出現(xiàn)NEB[6]。NEB是圍產(chǎn)期奶牛普遍存在的一種亞健康狀態(tài)，其會(huì)加劇圍產(chǎn)期其他代謝疾病酮癥、乳腺炎、乳熱、子宮內(nèi)膜炎等的發(fā)生，給奶牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。尤其奶牛等反芻動(dòng)物較單胃動(dòng)物相比，其代謝過程有極大不同，雖然反芻動(dòng)物與單胃動(dòng)物肝臟合成TAG的速率大致相同，但反芻動(dòng)物分泌VLDL的速率卻遠(yuǎn)低于單胃動(dòng)物[7]。本試驗(yàn)通過采集酮病不同狀態(tài)下奶牛血液并檢測(cè)其血清中VLDL-ApoB的含量進(jìn)一步證明了奶牛酮病的發(fā)生會(huì)進(jìn)一步抑制VLDL的合成、組裝及分泌過程。

研究表明，ApoB決定了VLDL從肝臟分泌的顆粒大小，但并不影響其分泌數(shù)量[8]，而異常大的VLDL顆粒會(huì)降低其向肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，進(jìn)而導(dǎo)致更多的TAG在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。本研究結(jié)果證實(shí)奶牛酮病的發(fā)生會(huì)抑制VLDL-ApoB分泌的同時(shí)，進(jìn)一步證明了奶牛酮病的發(fā)生會(huì)促使肝臟組織向血液中分泌更大的VLDL顆粒，從而說明了ApoB與VLDL顆粒大小兩者之間的相互作用關(guān)系對(duì)奶牛體內(nèi)TAG的轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積的影響。TAG、PL以及TC作為VLDL顆粒合成的重要原材料，其含量變化對(duì)VLDL顆粒的合成、組裝以及分泌的影響尚不明確，但在本試驗(yàn)中ELISA試劑盒以及LC-MS組學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒其組成中PL以及不同亞型的PL含量均較健康奶牛出現(xiàn)顯著或極顯著降低，表明在疾病狀態(tài)下PL含量的缺失可能是影響VLDL合成及組裝異常的重要因素，從而導(dǎo)致酮病的進(jìn)一步加重，甚至促進(jìn)奶牛脂肪肝的發(fā)生。

綜上所述，VLDL-ApoB分泌在奶牛酮病發(fā)生時(shí)受到抑制，同時(shí)促進(jìn)了異常大小的VLDL顆粒的分泌，PL作為VLDL合成組裝的重要脂質(zhì)部分，也在疾病過程中表現(xiàn)出了明顯異常。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明，可以通過調(diào)控ApoB以及增加PL合成的途徑來促進(jìn)VLDL顆粒的正常合成、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而減少TAG在肝臟內(nèi)的沉積而進(jìn)一步保證奶牛機(jī)體健康。