宋玉錫，張 鋒，張 江，夏 成，張洪友，徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

奶牛卵巢靜止(inactive ovaries,IO)是指受到某些因素影響，導(dǎo)致奶牛的卵巢功能處于靜止?fàn)顟B(tài)從而不能出現(xiàn)周期性的發(fā)情和排卵[1]。然而，近年來奶牛卵巢靜止的定義中涵蓋了卵泡直徑小于8 mm，無黃體和囊腫的乏情奶牛[2]。目前，隨著我國集約化牛場規(guī)模不斷擴大和單產(chǎn)持續(xù)增高，奶牛產(chǎn)后卵巢靜止所致的乏情發(fā)生率日趨升高。據(jù)報道，卵巢靜止占奶牛乏情的26.3%，而在高產(chǎn)奶牛中高達(dá)40%以上[3]。因此，卵巢靜止性乏情已成為現(xiàn)代奶牛業(yè)中高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后亟待解決的主要繁殖障礙問題。

氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析是代謝組學(xué)中最標(biāo)準(zhǔn)化的方法且因其特定的優(yōu)勢被作為代謝組學(xué)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”分析技術(shù)[4]。由于奶牛產(chǎn)后代謝異常與卵泡發(fā)育和卵巢靜止的發(fā)生密切相關(guān)，但有關(guān)奶牛產(chǎn)后卵巢靜止與機體代謝的關(guān)系仍不十分明確。為此，本試驗運用代謝組學(xué)的氣相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC-TOF-MS)技術(shù)以期獲得卵巢靜止奶牛與正常發(fā)情奶牛的血漿差異代謝物，探究其在奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生中所起的作用，為今后奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生機制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本試驗在黑龍江省某散欄式自由采食全混合日糧(TMR)的大型集約化奶牛場進(jìn)行。隨機選取產(chǎn)后45～60 d，年齡、胎次、體況相近的30頭試驗?zāi)膛＃ㄟ^直腸檢查和B超檢查卵巢及其卵泡大小，根據(jù)試驗?zāi)膛Ｊ欠癜l(fā)情，排除其他疾病等因素的影響，分為卵巢靜止組(IO，n=15)和發(fā)情組(E，n=15)。TMR日糧組成：精料8～9 kg、青貯17～20 kg、干草3.5～4.0 kg、脂肪300～400 g；TMR主要營養(yǎng)物質(zhì)包括：干物質(zhì)55.60%、粗蛋白16%、粗脂肪5.60%、鈣180 g、磷116 g、中性洗滌纖維39.10%、酸性洗滌纖維20.30%、產(chǎn)奶凈能7.33 MJ/DM。

1.2 血液樣品采集試驗?zāi)膛Ｓ诋a(chǎn)后45～60 d清晨榨乳前空腹進(jìn)行尾靜脈采血，將10 mL血液置于抗凝管(含肝素鈉)中，混勻后3 000×g離心10 min；將上清液(血漿)以12 000×g離心10 min，分裝，-80℃保存待測。

1.3 GC-TOF-MS試驗

1.3.1代謝物提取 每個樣本各取50 μL置于EP管中，加入200 μL甲醇，再加入5 μL(溶于超純水中1 g/L)L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s混勻，-20℃靜置10 min；將樣本在4℃，12 000×g離心15 min；移取180 μL上清液于EP管中，取每個樣本10 μL混合一起制成質(zhì)控(quality control,QC)樣本；將提取物置于真空濃縮器中進(jìn)行干燥，干燥后加入30 μL甲氧胺鹽酸鹽試劑(溶于吡啶20 g/L)，輕輕晃動混勻，置于80℃烘箱中孵育30 min；每個樣品加入40 μL BSTFA(含有1% TMCS)，再置于70℃烘箱中孵育1.5 h；室溫冷卻后，加入5 μL FAMEs(溶于氯仿)，隨機順序上機檢測。

1.3.2上機檢測 處理好的樣品上機檢測，使用Agilent 7890氣相色譜系統(tǒng)與Pegasus HT飛行時間質(zhì)譜儀結(jié)合進(jìn)行GC-TOF-MS分析。該系統(tǒng)使用涂有5%二苯基的DB-5MS毛細(xì)管柱，5%二苯基與95%二甲基聚硅氧烷(柱長30 m，內(nèi)徑250 μm，膜厚0.25 μm；J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA)交聯(lián)。以不分流模式注射1 μL等分試樣的分析物。使用氦氣作為載氣，前入口吹掃流量為3 mL/min，通過柱子的氣體流量為1 mL/min。溫度設(shè)置初始為50℃ 停留1 min，再以20℃/min的速率升至310℃，停留6 min。然后，注入溫度280℃、傳輸線溫度280℃和離子源溫度250℃，電子轟擊模式下的能量為-70 eV。在溶劑延遲4.70 min后，以全掃描模式獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，m/z范圍為50～500，速率為每秒12.5個光譜。

1.3.3數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用ChromaTOF軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[5]。應(yīng)用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜及保留時間指數(shù)匹配來定性物質(zhì)。最后將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以便于分析，首先基于四分位數(shù)距對偏移值過濾單個峰并去除噪音，保留單組或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)；以最小值二分之一的數(shù)值模擬方法填補原始數(shù)據(jù)中的缺失值，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理[6]。

1.3.4統(tǒng)計分析與差異代謝物篩選 數(shù)據(jù)整理后，首先進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。基于GC-MS的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的高維度和小樣本特性，可能存在關(guān)聯(lián)的無差異變量，無法進(jìn)行更好的可視化和后續(xù)分析。所以進(jìn)一步進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)，以得到更可靠的代謝物組間差異與試驗組相關(guān)程度的信息。

應(yīng)用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換加UV格式化處理。首先，應(yīng)用OPLS-DA方法建模分析，再用7折交叉驗證模型質(zhì)量。根據(jù)交叉驗證的R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測性)評判模型的有效性；最后，通過置換檢驗200次(n=200)，隨機改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機R2和Q2值，進(jìn)一步檢驗?zāi)Ｐ陀行浴?/p>

應(yīng)用多元變量統(tǒng)計與單變量統(tǒng)計分析結(jié)合的方法可以從不同角度觀察數(shù)據(jù)，避免假陽性錯誤或模型過擬合[7]。

本試驗使用的閾值標(biāo)準(zhǔn)為t檢驗的P值小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)大于1。

1.3.5差異代謝通路分析 根據(jù)多元統(tǒng)計分析與單變量分析結(jié)果最終篩選出的組間差異代謝物，通過MBRole(www.csbg.cnb.csic.es /mbrole/)網(wǎng)站的ID轉(zhuǎn)換獲得差異代謝物在KEGG的ID，在KEGG數(shù)據(jù)庫輸入差異代謝物ID及上下調(diào)關(guān)系，搜索相關(guān)代謝通路，再用代謝物通路分析網(wǎng)站MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)對差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝物總離子流圖分析與代謝物鑒定QC樣本的總離子流圖(TIC)疊圖(圖1)顯示，樣本質(zhì)譜峰的保留時間和相應(yīng)強度重現(xiàn)性良好，說明整個檢測過程中儀器穩(wěn)定。

圖1 所有QC樣本TIC疊圖

2.2 多元統(tǒng)計分析結(jié)果PCA得分圖顯示，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)(圖2)。由于兩組間有重疊，需進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果顯示，兩組分開明顯且基本都處于95%置信區(qū)間(圖3A)。置換檢驗結(jié)果顯示(圖3B)，R2Y=0.82接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況；而Q2的回歸線與縱軸的截距小于零；隨著置換保留度降低，Y變量比例增大，Q2逐漸下降；這表明原模型穩(wěn)健性良好，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.3 差異代謝物的篩選與鑒定應(yīng)用單變量分析對代謝物進(jìn)行統(tǒng)計分析，共篩選出16種血漿差異代謝物(表1)。其中，卵巢靜止組相對于發(fā)情組升高的有9種，分別是葡萄糖2、葡萄糖6-磷酸、D-果糖-2,6-二磷酸、D-半乳糖酸、甲酰乙內(nèi)脲、草氨酸、二氫羊毛甾醇、反油酸和α-生育酚；下降的有7種，分別是谷胱甘肽、L-焦谷氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷、3-羥基丙酸、單硬脂酸甘油酯、甘油酸、D-塔洛糖。

表1 發(fā)情組與卵巢靜止組奶牛的血漿差異代謝物

2.4 差異代謝物通路分析通過篩選的差異代謝物KEGG的ID，確立了發(fā)情奶牛與卵巢靜止奶牛血漿差異代謝物代謝通路分析圖(圖4)，分別為乙醛酸和二羧酸代謝(甘油酸)，β-丙氨酸代謝(3-羥基丙酸)，甘油脂代謝(D-半乳糖酸、甘油酸)，果糖和甘露糖代謝(葡萄糖2、D-果糖-2,6-二磷酸、葡萄糖6-磷酸)，丙酸代謝(3-羥基丙酸)，谷胱甘肽代謝(L-焦谷氨酸、谷胱甘肽)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(甘油酸)，類固醇生物合成(二氫羊毛甾醇)和嘧啶代謝(胸腺嘧啶脫氧核苷)。其中，甘油脂代謝和谷胱甘肽代謝的顏色較深，圓形較大，所以相對影響較大。

注：圖中橫坐標(biāo)表示排名第一的主成分得分；縱坐標(biāo)表示第二的主成分的得分；散點表示樣品

A.散點圖，橫坐標(biāo)表示第一主成分的預(yù)測得分，縱坐標(biāo)表示正交主成分得分;B.置換檢驗結(jié)果，橫坐標(biāo)表示置換保留度，縱坐標(biāo)表示R2Y或Q2的取值，虛線表示回歸線

注：氣泡所在橫坐標(biāo)和氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮?，越大影響因子越大；氣泡所在縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的P值(取負(fù)自然對數(shù)，即-lnP-value)，顏色越深P值越小，富集程度越顯著

3 討論

本試驗通過KEGG代謝通路對GC-MS篩選出的差異代謝物進(jìn)行分析，構(gòu)建了GC-MS網(wǎng)絡(luò)代謝圖譜(圖5)。由于α-生育酚和胸腺嘧啶脫氧核苷酸與其他代謝物的關(guān)系不明，未列在網(wǎng)絡(luò)代謝圖中。

3.1 糖代謝與卵巢靜止的關(guān)系葡萄糖可以參與包括糖酵解、糖異生、己糖胺途徑和磷酸戊糖途徑在內(nèi)的多種代謝途徑。本試驗中IO奶牛血漿中葡萄糖2、葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-2,6-二磷酸含量上升，說明IO奶牛的糖酵解或糖異生過程增強。這些糖中間代謝物的升高提示IO奶牛體內(nèi)能量缺乏，糖代謝增強為機體供能，或滿足機體泌乳合成乳糖所需。IO奶牛血漿中塔洛糖含量降低，D-半乳糖酸含量升高。塔洛糖是由纖維二糖2-差向異構(gòu)酶催化半乳糖的酮-醛異構(gòu)化生成[8]，在奶牛卵巢靜止發(fā)生中的作用未見報道。D-半乳糖酸參與半乳糖代謝，是由半乳糖通過半乳糖氧化酶轉(zhuǎn)化而來，可生成D甘油進(jìn)入磷酸戊糖途徑。D-半乳糖(D-gal)是一種簡單的單糖，可以作為正常營養(yǎng)素在體內(nèi)代謝，主要用于乳糖的合成[9]。乳腺中葡萄糖轉(zhuǎn)換為半乳糖，半乳糖再與葡萄糖結(jié)合生成乳糖[9]。由此可見，IO奶牛產(chǎn)奶量高，機體乳糖合成需求增高，葡萄糖向半乳糖的轉(zhuǎn)化增強，促進(jìn)了半乳糖代謝，與本試驗結(jié)果相符。

注：升高/降低是指卵巢靜止奶牛

3.2 脂代謝與卵巢靜止的關(guān)系甘油酸主要參與甘油脂代謝。甘油醛可以氧化生成甘油酸，然后在甘油脫氫酶作用下，生成甘油；也可磷酸化后生成甘油酸3磷酸，再參與糖異生或糖酵解途徑。單硬脂酸甘油酯由長鏈脂肪酸與丙三醇酯化而來。甘油酯通常指由甘油和脂肪酸經(jīng)酯化所生成的酯類，主要用于細(xì)胞內(nèi)能量儲存，與膽固醇酯細(xì)胞內(nèi)脂滴一起形成作為熱量儲庫[10]。因此，本試驗中IO奶牛血漿中甘油酸和單硬脂酸甘油酯含量降低，表明甘油脂代謝減弱，甘油酯的合成減少，脂肪儲備動員后用于合成乳脂和供能。反油酸是由油酸轉(zhuǎn)化而來的，油酸以甘油酯的形式存在于動物脂肪中。本試驗中IO奶牛血漿中反油酸含量的升高，表明機體脂肪動員增強，油酸甘油酯分解供能，從而導(dǎo)致反油酸增多。而脂肪動員增強后產(chǎn)生的高濃度游離脂肪酸會造成卵巢卵泡內(nèi)的脂毒性，影響卵母細(xì)胞發(fā)育，降低奶牛的生育力[11]。二氫羊毛甾醇主要參與類固醇的生物合成，類固醇在雌性生殖中起著至關(guān)重要的作用，特別是參與排卵過程和牛的卵母卵丘復(fù)合體排卵前成熟[12-13]。由此可見，本試驗中IO奶牛血漿中二氫羊毛甾醇含量升高，可能是由于類固醇合成受阻，性激素的合成受到障礙。

3.3 氨基酸代謝與卵巢靜止的關(guān)系甲酰乙內(nèi)脲參與精氨酸和脯氨酸代謝通路，是精氨酸參與尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，主要用于合成肌氨酸。肌氨酸以磷酸肌酸形式儲存在肌肉中，促進(jìn)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成[14]。本試驗中IO奶牛血漿中甲酰乙內(nèi)脲含量升高，表明尿素循環(huán)精氨酸分解增強，向磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化增強。3-羥基丙酸參與β-丙氨酸代謝。本試驗中IO奶牛機體能量缺乏，因此體內(nèi)的丙酮酸主要用于乙酰輔酶A的生成參與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)供能，而減少向丙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，且3-羥基丙酸向β-丙氨酸代謝增強，使得血漿中3-羥基丙酸含量降低，以便滿足機體對能量的需要。草氨酸參與嘌呤代謝，是黃嘌呤的分解代謝產(chǎn)物，而草氨酸繼續(xù)代謝為草酸和氨。草氨酸是丙酮酸的等排和等電子類似物[15]。而草氨酸生成的草酸可衍生為草酰胺并參與TCA循環(huán)。草氨酸的升高提示IO奶牛的嘌呤代謝與TCA循環(huán)可能增強。L-焦谷氨酸主要參與γ-谷氨酰循環(huán)和谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)代謝。L-焦谷氨酸可以由谷氨酰胺分子失去氨?；纬桑部捎晒劝彼岘h(huán)化轉(zhuǎn)變而來[16]。γ-谷氨酰循環(huán)是六酶循環(huán)，是GSH合成和降解的主要途徑[17]。GSH的抗氧化特性可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷[18]。氧化應(yīng)激對生殖系統(tǒng)的不利影響涉及卵母細(xì)胞脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，卵巢和子宮內(nèi)膜的損傷，從而影響生育力[19]。因此，本試驗中IO奶牛血漿中L-焦谷氨酸含量的降低，導(dǎo)致了谷氨酸含量也隨之降低，隨后導(dǎo)致其合成的GSH含量降低。這不利于卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，可能是造成奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止的因素之一。

3.4 其他代謝物與卵巢靜止的關(guān)系維生素E是一種抗氧化劑，其水解產(chǎn)物為生育酚。維生素E的生物活性高度依賴于用于保留α-生育酚和排泄非α-生育酚形式的調(diào)節(jié)機制[20]。α-生育酚可作為過氧自由基清除劑來保護(hù)膜和脂蛋白中的多不飽和脂肪酸，還能促進(jìn)雌性激素分泌，從而提高生育能力。維生素E不能通過自身合成，只能從食物中獲取，由于兩組試驗?zāi)膛５娘暳舷嗤?，所以兩組奶牛從食物攝取的維生素E含量應(yīng)相差不大。然而，本試驗中IO奶牛血漿中α-生育酚含量升高，提示其利用率降低。

胸腺嘧啶脫氧核苷酸主要參與嘧啶代謝，其合成需要谷氨酰胺與ATP。ATP是所有生物體中的一種通用能源，在生物過程中起著重要作用，包括膜離子通道泵的調(diào)節(jié)，DNA復(fù)制，生物合成和細(xì)胞代謝等[21]。本試驗中在卵巢靜止奶牛血漿中胸腺嘧啶脫氧核苷酸的減少，提示與機體谷氨酰胺或ATP不足，或DNA分解增強，可能與機體能量缺乏和氨基酸分解代謝增強有關(guān)，但與奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。

本研究應(yīng)用GC-TOF-MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析和單變量分析及生物信息學(xué)技術(shù)，獲得了卵巢靜止奶牛血漿中16種差異代謝物，其中卵巢靜止組相對于發(fā)情組升高的有9種，下降的有7種。其主要參與糖代謝、甘油脂代謝、氨基酸代謝、類固醇生物合成和谷胱甘肽代謝等通路。這些差異代謝物為今后奶牛卵巢靜止機制的研究提供了新的方向。