郝娜，田曉彤，李萌萌，常家禎，周京，戚慶煒，蔣宇林，周希亞*，劉俊濤

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

羊水細(xì)胞染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的核心項(xiàng)目[1]。北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科遺傳實(shí)驗(yàn)室從2000年開始使用原位法收獲羊水細(xì)胞，沿用至今。原位法培養(yǎng)材料種類較多，除常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶之外[2]，還使用過蓋玻片培養(yǎng)皿、腔式載玻片培養(yǎng)盒、盒式載玻片培養(yǎng)盒、載玻片培養(yǎng)瓶等。2018年開始，本實(shí)驗(yàn)室采用新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒，并同時(shí)應(yīng)用常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶進(jìn)行雙線平行培養(yǎng)，分別行新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒原位法(以下簡稱載玻片原位法)收獲和常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶消化法(以下簡稱培養(yǎng)瓶消化法)收獲，即載玻片原位法、培養(yǎng)瓶消化法同時(shí)對羊水細(xì)胞培養(yǎng)收獲制片。2019年，采用兩種方法對1 568例樣本進(jìn)行培養(yǎng)，比較培養(yǎng)成功率和有效的染色體核型數(shù)目，現(xiàn)總結(jié)分析如下。

資料和方法

一、研究對象

收集2019年1～12月在北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的1 568例孕婦的羊水樣本。產(chǎn)前診斷的指征包括高齡妊娠、血清學(xué)唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(Noninvasive prenatal test，NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)、胎兒超聲異常及不良孕產(chǎn)史等。

二、儀器與試劑

1.儀器：離心機(jī)，恒溫水浴箱，二氧化碳培養(yǎng)箱，烤箱，GSL120全自動掃片系統(tǒng)、Cytovision染色體核型分析系統(tǒng)(徠卡，德國)。

2.試劑與耗材：胰酶、D-hanks溶液、新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒(上海樂辰生物)，羊水培養(yǎng)基(CHANG，美國)，秋水仙素(上海沃凱)，氯化鉀、枸櫞酸鈉、冰乙酸(北京國藥)，Trypsin-EDTA(Gibco，美國)，Giemsa染液(Sigma，美國)，常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶(Corning，美國)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

三、研究方法

1.標(biāo)本采集：孕16～22+6周時(shí)，在B超引導(dǎo)下行經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，將15～20 ml羊水分別置于2個(gè)15 ml無菌離心管中，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.接種：羊水兩管，平衡離心2 000 rpm×10 min，各管吸掉部分上清后留取1 ml混懸細(xì)胞，一管細(xì)胞加入2 ml羊水培養(yǎng)基，吹打混勻后直接接種在卡扣式載玻片培養(yǎng)盒；另一管細(xì)胞加入4 ml相同羊水培養(yǎng)基，吹打混勻后接種至塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.換液：培養(yǎng)5～7 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞集落>5個(gè)/瓶，鏡下可見透亮細(xì)胞較多時(shí)，倒出原培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一塑料培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)備用。在原卡扣式載玻片培養(yǎng)盒及塑料培養(yǎng)瓶中分別加入新鮮培養(yǎng)液4 ml，并于次日進(jìn)行收獲處理。

4.收獲：(1)載玻片原位法收獲：每盒加入秋水仙素工作液100 μl(終濃度為0.25 μg/ml)，37℃培養(yǎng)箱孵育，45 min后吸掉培養(yǎng)液，加入預(yù)溫的5 ml低滲液(0.2%氯化鉀+0.2%枸櫞酸鈉)，37℃培養(yǎng)箱低滲。25 min后加入1 ml 固定液(甲醇：冰乙酸按3∶1體積比配制)，室溫固定5 min。清除培養(yǎng)盒內(nèi)液體，加入固定液4 ml，室溫固定15 min。重復(fù)一次固定步驟，打開塑料卡扣，將載玻片從塑料方框上分拆下來，置烤片機(jī)上烤干后收入玻片架，80℃烤片3 h。(2)培養(yǎng)瓶消化法收獲：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素工作液100 μl(終濃度為0.25 μg/ml)，置于37℃水浴箱中孵育15 min。將羊水上清液倒入離心管中，并在培養(yǎng)瓶中加入3 ml 0.05% Trypsin-EDTA，置于37℃水浴箱中孵育15 min。培養(yǎng)液終止消化，用吸管用力吹打細(xì)胞面，倒入離心管中，2 000 rpm離心5～10 min；棄上清，加入5 ml低滲液，吹打混勻后置入37℃水浴箱中孵育15 min；加入1 ml固定液，輕輕混勻，靜置5 min，2 000 rpm離心10 min；棄上清，加入5 ml固定液，輕輕混勻，室溫下作用15 min；2 000 rpm離心10 min后棄上清液。重復(fù)上述步驟，15 min后離心棄上清，依據(jù)細(xì)胞沉淀量調(diào)配懸液，在玻片上滴加2～3滴懸液，盡量保證懸液平鋪在載玻片上。置烤片機(jī)上烤干后收入玻片架，80℃烤片3 h。

5.閱片分析：以人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2016)G顯帶400條帶水平為標(biāo)準(zhǔn)分析染色體核型，使用Cytovision分析系統(tǒng)掃描并采集圖像，計(jì)數(shù)原位收獲載玻片中至少5個(gè)克隆，分析5個(gè)細(xì)胞，核型配對2個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)消化收獲載玻片中至少10個(gè)細(xì)胞，分析5細(xì)胞，核型配對2個(gè)細(xì)胞[3]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共納入1 568例孕婦，年齡19～48歲，平均年齡(34.9±4.5)歲，孕周為16～22+6周，平均孕周(18.6±1.8)周。產(chǎn)前診斷指征見表1。

表1 1 568例受檢者產(chǎn)前診斷指征

二、不同孕周組別培養(yǎng)結(jié)果比較

按不同孕周分組分別統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)方法的成功率和失敗率。1 568例羊水樣本均為雙線培養(yǎng)及制片，其中常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)有2例細(xì)菌污染，培養(yǎng)成功率99.87%(1 566/1 568)。新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒培養(yǎng)時(shí)有3例細(xì)菌污染，同時(shí)有2例因卡扣式培養(yǎng)盒密封處理不合格導(dǎo)致漏液，培養(yǎng)成功率99.68%(1 563/1 568)。兩種方法的總培養(yǎng)成功率無顯著差異(P=0.26)(表2)。

表2 不同孕周羊膜腔穿刺后羊水培養(yǎng)結(jié)果比較(%)

三、培養(yǎng)條件及有效核型比較

常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶法所獲得的貼壁細(xì)胞集落、可計(jì)數(shù)核型及可分析核型多于卡扣式培養(yǎng)盒法。但在培養(yǎng)液用量、培養(yǎng)時(shí)長、收獲操作時(shí)間上，卡扣式培養(yǎng)盒法都要優(yōu)于常規(guī)塑料瓶培養(yǎng)法(表3)。

表3 兩種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)條件及獲得有效核型情況比較(-±s)

四、染色體核型分析

1 568例樣本中共發(fā)現(xiàn)98例異常核型，包括30例結(jié)構(gòu)異常和68例數(shù)目異常。數(shù)目異常包括29例21三體、12例18三體、2例9號三體嵌合、25例性染色體數(shù)目異常；染色體嵌合共8例，1例為結(jié)構(gòu)異常嵌合，其余7例均為數(shù)目異常嵌合。

討 論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，新技術(shù)不斷被引入到臨床應(yīng)用中，產(chǎn)前診斷向更精確、更快速的方向發(fā)展，但染色體核型分析依然是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域無可替代的重要手段，尤其對于嵌合體、平衡易位、復(fù)雜易位、倒位等染色體異常的檢出具有重要意義。在我國，羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析依然是絕大多數(shù)產(chǎn)前診斷中心的常規(guī)診斷方法。因此，提高細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量、獲得滿意的核型以供分析，對確保羊水產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域中多種培養(yǎng)方式及全自動掃片系統(tǒng)、智能分析軟件已廣泛使用，在緩解技師鏡下閱片壓力的同時(shí)，提高了異常檢出率及工作效率。核型分析自動化推動著前期培養(yǎng)及收獲流程方法的改進(jìn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室大部分均使用消化法進(jìn)行收獲處理，無法區(qū)分單細(xì)胞來源或多細(xì)胞來源[4-6]。少數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用載玻片盒羊水細(xì)胞培養(yǎng)法，即原位法收獲細(xì)胞[7-9]，雖可鑒別細(xì)胞來源，但在接種環(huán)節(jié)中需要注意，首次接種要將羊水細(xì)胞懸液滴加在載玻片表面，不要溢出，以避免丟失細(xì)胞，并需在24 h后追加2～3 ml新鮮培養(yǎng)液。該方法通常采用普通載玻片培養(yǎng)盒，多次操作有增加污染的可能。因此，本研究對新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

高質(zhì)量染色體核型可以提高產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確率，每一個(gè)操作環(huán)節(jié)都會影響染色體核型質(zhì)量[10]。本實(shí)驗(yàn)室多年來一直采用原位法培養(yǎng)細(xì)胞，并不斷探索不同培養(yǎng)器皿及方法的成功率、獲得核型情況及培養(yǎng)條件。首先，原位培養(yǎng)具有保留細(xì)胞克隆性、可追溯羊水中多胚層來源的細(xì)胞性質(zhì)、且對嵌合體診斷具有明顯的優(yōu)勢[11]。本研究共發(fā)現(xiàn)8例染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)嵌合，嵌合比例均從新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒的原位培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得。相對準(zhǔn)確的嵌合比例可以給臨床診斷提供依據(jù)，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供必要的的實(shí)驗(yàn)室信息[12]。其次，常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶與新型(卡扣式)培養(yǎng)盒同步培養(yǎng)羊水細(xì)胞，兩種培養(yǎng)材料的培養(yǎng)成功率無顯著差異。常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶因培養(yǎng)瓶底部面積大，所獲得的貼壁細(xì)胞集落、可計(jì)數(shù)核型及可分析核型多于載玻片原位法。但在培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液用量上，載玻片原位法均占優(yōu)勢。載玻片原位法使用的載玻片為玻璃材料，玻璃表面具有天然的正電荷，使細(xì)胞更容易貼壁生長。貼附生長細(xì)胞的生長過程要經(jīng)過3個(gè)階段：潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。羊水細(xì)胞培養(yǎng)至6～7 d時(shí)已處于指數(shù)生長期，大量細(xì)胞進(jìn)入分裂期[13]。本研究選擇第5天換液處理，24 h后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行收獲制片。細(xì)胞收獲流程結(jié)束打開塑料卡扣，將載玻片從塑料方框上分拆下來，直接將載玻片進(jìn)行短暫熏蒸。在載玻片固定液蒸發(fā)過程中，染色體因吸水而顯著膨脹，這是染色體伸長、染色體中期擴(kuò)散以及高分辨率帶紋出現(xiàn)的先決條件[14]。為了得到高質(zhì)量的染色體核型，培養(yǎng)瓶消化法在滴片前需對玻片清潔并進(jìn)行熏蒸處理，滴片過程中仔細(xì)觀察水分蒸發(fā)情況并在滴片時(shí)轉(zhuǎn)換樣本標(biāo)簽。載玻片原位法收獲過程中沒有滴片步驟，可以減少此類錯(cuò)誤的發(fā)生；另外，載玻片原位法培養(yǎng)的細(xì)胞一般在培養(yǎng)第7天即可收獲制片，特殊病例可以在10 d內(nèi)得到染色體核型結(jié)果，相比于培養(yǎng)瓶消化法培養(yǎng)第9天才可進(jìn)行收獲相關(guān)操作，縮短了產(chǎn)前診斷報(bào)告的發(fā)放時(shí)間。

產(chǎn)前診斷指征中，對于唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)及NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例，相關(guān)指南規(guī)定均需有創(chuàng)操作獲取胎兒樣本進(jìn)行產(chǎn)前診斷[15-17]。由于唐氏篩查及NIPT的檢測孕周大多在中孕早期，高風(fēng)險(xiǎn)病例獲得結(jié)果時(shí)往往不足18周甚至不足17周。本研究統(tǒng)計(jì)了小于孕18周的病例數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)成功率及有效核型數(shù)目均與孕18～20周組一致。因此對于篩查高風(fēng)險(xiǎn)病例，可以適當(dāng)提前穿刺時(shí)間。而對于超聲異常的胎兒，產(chǎn)前診斷中微陣列分析及測序技術(shù)逐步被大家認(rèn)可[18-19]，但仍需羊水細(xì)胞染色體核型分析除外結(jié)構(gòu)異常[20]。本研究中對胎兒超聲異常或不良孕產(chǎn)史的孕婦分別留取10 ml羊水送檢微陣列分析，15 ml羊水行染色體核型分析。因此雙線培養(yǎng)僅允許分別將6 ml和9 ml羊水的沉淀細(xì)胞分別接種于新型(卡扣式)培養(yǎng)盒和常規(guī)塑料瓶。在羊水量僅為6 ml的情況下，載玻片原位法的有效核型多于培養(yǎng)瓶消化法，所獲得的染色體核型有效解決了對染色體結(jié)構(gòu)的判斷。胎兒本身是否存在染色體結(jié)構(gòu)變異對其決定此次妊娠結(jié)局及再次妊娠均有指導(dǎo)意義[21]。

本研究7例培養(yǎng)失敗的病例中，5例為污染，不除外操作因素及耗材本身消毒問題。載玻片原位法2例漏液的病例原因?yàn)樾滦?卡扣式)培養(yǎng)盒密封問題，經(jīng)和廠家溝通后再無此種情況發(fā)生。

綜上所述，新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)法具有操作步驟簡單、耗材用量少、羊水需求量小、可相應(yīng)提前產(chǎn)前診斷時(shí)間等優(yōu)勢，對于嵌合體的嵌合比例確定可能具有優(yōu)勢，可以與常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法結(jié)合，提高羊水細(xì)胞染色體核型分析的效率。兩種方法同時(shí)處理羊水細(xì)胞，可以及時(shí)有效地解決大片段結(jié)構(gòu)異常及確定嵌合體比例，適合臨床使用。