高 振，劉 娟，孫 豪，姜 平*，趙志輝 *

(1.廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524008；2.吉林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

支持細(xì)胞(Sertoli cells,SCs)是由意大利學(xué)者Enricol Sertoli于1865年首先提出并加以概述的。SCs由早期胚胎生殖脊細(xì)胞發(fā)育而來，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則圓錐狀，與間質(zhì)細(xì)胞等一起參與睪丸曲細(xì)精管的形成。研究表明，在雄性動物睪丸內(nèi)，每個SCs只能支持有限數(shù)量的生殖細(xì)胞進(jìn)入精子發(fā)生過程，每日精子產(chǎn)量與SCs的數(shù)量存在正相關(guān)[1]。因此，睪丸中SCs的數(shù)量決定了睪丸的最終大小和每天的精子產(chǎn)量[2]。睪丸中的SCs在生長發(fā)育過程中，可被分為未成熟型和成熟型2種。在大多數(shù)物種中，未成熟SCs的增殖在出生后有2個高峰期，其中第1個高峰期在胎兒或新生兒時期，另一個高峰期在初情期，此時的SCs為未成熟SCs[3-4]。隨著動物個體的性成熟，睪丸中曲細(xì)精管管腔出現(xiàn)，未成熟SCs逐漸分化為成熟SCs，同時，細(xì)胞發(fā)生一系列的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，包括芳香化酶逐漸減少、FSH受體逐漸增多，并且開始具有合成轉(zhuǎn)鐵蛋白的能力[5]。研究表明，未成熟SCs的數(shù)量和功能將影響動物個體的生精效率和繁殖性能，而成熟SCs會喪失增殖分化的能力，因此，未成熟SCs的體外分離培養(yǎng)在生殖細(xì)胞的研究中是必不可少的。目前，從睪丸組織中分離SCs的方法包括機(jī)械分離法和酶消化法，但是現(xiàn)有方法普遍存在著分離步驟繁瑣、細(xì)胞純度較低、無法連續(xù)傳代等問題。為了進(jìn)一步深入研究睪丸未成熟SCs的各種功能和發(fā)生機(jī)制，建立一套穩(wěn)定的分離純化和原代培養(yǎng)體系是必要的。本試驗(yàn)通過優(yōu)化現(xiàn)有的新生牛睪丸未成熟SCs體外分離純化及鑒定方法，以期建立一種簡單、快捷且高效地獲得高純度睪丸未成熟SCs的原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及材料中國西門塔爾牛睪丸組織，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；膠原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶、DMEM/F12、DPBS購自美國HyClone公司；福爾根DNA染色液購自上海源葉生物科技有限公司；兔源一抗(GATA4，F(xiàn)ASL，KRT-18)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔FITC標(biāo)記二抗購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 未成熟SCs的分離與單細(xì)胞懸液制備牛場采集的新生牛新鮮睪丸組織用含有青霉素、鏈霉素和慶大霉素的PBS沖洗，用75%酒精浸泡10 min后，轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中用眼科剪剪開表面被膜以及白膜，用異物針小心剝離曲細(xì)精管，再將其轉(zhuǎn)移至盛有5×雙抗PBS清洗3～4次；充分剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5倍體積1.0 g/L的Ⅳ型膠原酶，于37℃水浴中消化30 min，期間每3 min取出振蕩1次。消化結(jié)束后1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液；采用相同條件將上一步取得的懸濁液用0.25%胰蛋白酶消化15 min并用培養(yǎng)液終止，將未成熟SCs-生殖細(xì)胞團(tuán)懸液轉(zhuǎn)移到15 mL無菌離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄掉上清液，加入含2×雙抗的PBS沖洗；200目尼龍網(wǎng)過濾掉其他物質(zhì)，濾液1 500 r/min離心5 min；細(xì)胞沉淀用含10%血清的DMEM/F-12重懸，調(diào)整密度接種至培養(yǎng)皿中，并置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 未成熟SCs的純化及傳代培養(yǎng)采用差速貼壁法純化所分離的細(xì)胞。培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入新的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入0.25%的胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞稍有脫落即刻加入新的完全培養(yǎng)基終止消化，待細(xì)胞長滿底壁，重復(fù)上述操作3～4次。由于睪丸曲細(xì)精管中只有精原細(xì)胞和SCs，在差速貼壁過程中，4 h內(nèi)精原細(xì)胞無法貼壁生長，因此可以保證分離純化到的細(xì)胞多為睪丸未成熟SCs。

1.4 SCs形態(tài)學(xué)鑒定

1.4.1SCs的福爾根染色 待二代SCs長滿后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，按試劑盒所附說明書對所分離細(xì)胞進(jìn)行福爾根染色。操作程序?yàn)椋河肅arnoy液固定細(xì)胞20 min；棄去固定液；用蒸餾水搖床浸洗1 min；將細(xì)胞與弱酸工作液(預(yù)熱)放置于60℃水浴中孵育8 min；棄去工作液并用蒸餾水搖床浸洗2 min；加入Schiff Reagent，室溫避光染色45 min；用現(xiàn)配的SO2水工作液搖床浸洗3次，每次90 s；經(jīng)梯度乙醇(乙醇含量：70%，80%，95%，100%)依次脫水后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2SCs標(biāo)志性基因的RT-PCR鑒定 待SCs長滿后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次后，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總RNA，并利用PrimeScript RT試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增SCs標(biāo)志基因SCF、GDNF和BMP4；引物由Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 RT-PCR各基因引物序列、產(chǎn)物長度及基因ID

RT-PCR體系(20 μL)：2×PCR mix 10 μL、上、下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 未成熟SCs的免疫熒光染色將細(xì)胞融合度為85%的原代細(xì)胞以50%細(xì)胞融合度傳至6孔板，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，并用PBS清洗2次，按試劑盒所附說明書對所分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色程序?yàn)椋杭尤胩崆邦A(yù)冷(―20℃)的冰甲醇固定細(xì)胞25 min，棄去液體；加入0.1% Triton X-100溶液室溫避光處理10 min，棄去液體；加入5%脫脂奶粉封閉30 min，棄去封閉液；分別在孔中加入已稀釋的GATA4、FASL和KRT-18的一抗，4℃孵育過夜；棄去液體；加入已稀釋的FITC標(biāo)記二抗，37℃恒溫箱孵育2 h；加入0.5% PI避光處理5 min。以上步驟更換溶液時均在搖床上用PBS洗滌3次，每次5 min。染色完畢后，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 未成熟SCs體外培養(yǎng)特性經(jīng)差速貼壁法純化后，此時絕大部分細(xì)胞為未成熟SCs。剛接種的未成熟SCs體積較小，呈圓形或橢圓形，折光性強(qiáng)，直徑約10 μm。約2 h后，所分離細(xì)胞開始發(fā)生極化，4 h后可觀察到部分未成熟SCs胞體伸展，細(xì)胞四周伸出突起，形態(tài)不規(guī)則，此后胞質(zhì)逐漸增大。培養(yǎng) 48 h后，細(xì)胞成膜狀平鋪于培養(yǎng)皿底，胞質(zhì)中可見顆粒狀物質(zhì)或空泡，相鄰細(xì)胞發(fā)生交錯連接。隨著培養(yǎng)時間的延長，睪丸未成熟SCs的折光性逐漸降低。高倍鏡下觀察可見，所分離的未成熟SCs核仁明顯，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中間或稍偏位。鏡下觀察結(jié)果表明，分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞基本符合睪丸SCs的形態(tài)學(xué)特征(圖1)。

A.經(jīng)差速貼壁法純化后的未成熟SCs體外培養(yǎng)48 h(×400)； B.體外培養(yǎng)1周后的未成熟SCs(×200)

2.2 未成熟SCs的福爾根染色相差顯微鏡下觀察福爾根染色后的未成熟SCs發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)不著色，細(xì)胞核淡染，核仁形態(tài)明顯，衛(wèi)星核小體位于核仁兩側(cè)，呈紫紅色(圖2)。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞符合SCs的生物學(xué)特征。

圖中箭頭所指為衛(wèi)星核小體

2.3 SCs特異性表達(dá)基因的RT-PCR骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (bone morphogenetic protein 4,BMP4)、干細(xì)胞因子(KIT ligand,KITLG/SCF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)，是未成熟SCs特異性分泌的生長因子[6]，在未成熟SCs參與維持精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。RNA產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，提取的RNA有明顯的18S和28S條帶，D260/D280在1.8～2.1，無DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于下一步試驗(yàn)(圖3)。反轉(zhuǎn)錄后，利用RT-PCR法檢測SCs的標(biāo)志性基因，結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞顯著表達(dá)SCs特異性基因SCF、GDNF和BMP4(圖4)。說明分離的細(xì)胞是SCs。

1～4.為二代未成熟支持細(xì)胞RNA

M.DL2000 DNA Marker;1.BMP4;2.SCF;3.GDNF

2.4 SCs特異性表達(dá)基因的免疫熒光染色為了進(jìn)一步鑒定所分離細(xì)胞的類型及純度，選擇SCs特異性表達(dá)的基因GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)和FAS配體(fas ligand,FASL)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。GATA4是影響生殖功能的轉(zhuǎn)錄因子之一。研究表明，GATA4可參與哺乳動物組織生長、發(fā)育、分化和基因表達(dá)過程[7]，如雄性性別分化、類固醇激素合成和細(xì)胞存活等多個生殖軸的生理活動，其在SCs中高表達(dá)[8]。FASL是結(jié)合到死亡受體TNFRSF6/FAS的細(xì)胞因子，對精子的發(fā)生起重要作用，能夠抑制淋巴細(xì)胞侵入生精小管，避免生殖細(xì)胞誘發(fā)自身免疫反應(yīng)[9]。在睪丸組織中，僅SCs表達(dá)FASL。免疫熒光染色法結(jié)果顯示，所分離的細(xì)胞均表達(dá)SCs特異性蛋白FASL和GATA4，說明所分離的細(xì)胞是SCs且純度較高。

A.基因染色(綠色)；B.PI(核標(biāo)記物)染色(紅色)；C.合并圖(×100)

2.5 未成熟SCs特異性標(biāo)志基因的免疫熒光染色為了鑒定所分離SCs成熟度，選擇未成熟SCs特異性穩(wěn)定標(biāo)志物KRT-18進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。角蛋白18(keratin 18，KRT-18)是中間絲的標(biāo)志物，在人的睪丸中，它被用來識別生精小管中的未成熟SCs[9]。在鼠、豬等物種中，曾被作為未成熟SCs鑒定的標(biāo)志物之一[10-11]。未成熟SCs特異性表達(dá)基因KRT-18的免疫熒光染色結(jié)果顯示，幾乎所有的細(xì)胞均呈KRT-18陽性(圖6)。上述結(jié)果表明，所分離的SCs為未成熟SCs且純度很高，可用于后續(xù)研究。

A.基因染色(綠色)；B.PI(核標(biāo)記物)染色(紅色)；C.合并圖(×200)

3 討論

隨著對影響雄性繁殖性能因素研究的加深，SCs也越來越受到關(guān)注。眾多研究表明，睪丸SCs是維持睪丸代謝和精子發(fā)生的重要細(xì)胞之一。在精子發(fā)生過程中，SCs不但為生殖細(xì)胞提供特殊的結(jié)構(gòu)支持和免疫保護(hù)空間(血睪屏障)，以維持曲細(xì)精管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)生殖細(xì)胞成熟，還能提供精子發(fā)生所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素信號等物質(zhì)，以保障精子發(fā)生過程的高效穩(wěn)定[12-14]。不僅如此，SCs具有很強(qiáng)的吞噬能力，能夠吞噬退化的生精細(xì)胞[15]。由于其在精子發(fā)生過程中的這些特殊支持保護(hù)作用，SCs又被稱為“保姆”細(xì)胞。沒有SCs的物理和代謝上的支持，生殖細(xì)胞的分化、減數(shù)分裂和轉(zhuǎn)化為精子的過程就不會發(fā)生。研究表明，成熟SCs在增殖分化的過程中會逐漸喪失增殖分化的能力，而未成熟SCs的數(shù)量和功能將影響動物個體的生精效率和繁殖性能，因此未成熟SCs在動物生殖研究中作為一種必要的試驗(yàn)材料具有重要的研究價值。

未成熟SCs是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的細(xì)胞，國內(nèi)外關(guān)于未成熟SCs分離和培養(yǎng)的報(bào)道很多[16-19]。研究表明，不同的分離純化方法對未成熟SCs的獲得量及最終狀態(tài)影響很大。孫秀娟[20]通過對比分別消化犢牛的睪丸組織與曲細(xì)精管后未成熟SCs有效細(xì)胞數(shù)的不同，發(fā)現(xiàn)消化曲細(xì)精管能更好地滿足未成熟SCs的分離試驗(yàn)。王雪等[21]通過優(yōu)化未成熟SCs的純化方式，發(fā)現(xiàn)未成熟SCs體外培養(yǎng)至第10代即進(jìn)入平臺生長期，而于磊等[22]通過優(yōu)化兩步酶法消化睪丸組織，最終將未成熟SCs體外培養(yǎng)至20代。本試驗(yàn)結(jié)合前人的分離純化方法，選取曲細(xì)精管進(jìn)行第一步分離，同時縮短兩步酶消化的時間，既保證了未成熟SCs的獲得量，也減少了酶對于細(xì)胞的損害，增加了未成熟SCs的存活率，實(shí)驗(yàn)室分離的未成熟SCs體外培養(yǎng)至8代左右增殖進(jìn)入平臺期。本試驗(yàn)中，原代未成熟SCs傳代時，經(jīng)含0.25% EDTA的胰酶消化2 min即可消化完全。剛傳代的未成熟SCs生長速度快，以50%密度傳代，24 h即可鋪滿整個細(xì)胞培養(yǎng)板，低密度傳代的原代未成熟SCs仍保持原來的生物活性，但形態(tài)會發(fā)生一定改變，這可能與低密度的未成熟SCs間不能快速的構(gòu)成交錯連接有關(guān)，因此，建議牛原代未成熟SCs傳代稀釋比例為1∶4～1∶2。原代未成熟SCs傳至5代后逐漸發(fā)生纖維化，細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞質(zhì)邊緣開始出現(xiàn)拉絲狀，且細(xì)胞質(zhì)空泡增多，這一結(jié)果與姚玲等[23]的研究結(jié)果一致。于磊等[22]通過對未成熟SCs長期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)未成熟SCs體外培養(yǎng)第15代時仍具有完整的二倍體核型。但就細(xì)胞狀態(tài)而言，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞纖維化程度逐漸增加，傳代時間間隔也逐漸延長，因此，5代以內(nèi)的細(xì)胞是相對良好的試驗(yàn)研究材料。

未成熟SCs的鑒定方法有很多種，如根據(jù)未成熟SCs特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的有無進(jìn)行鑒定的HE染色、油紅O染色、細(xì)胞核型分析、福爾根染色和透射電鏡觀察，以及根據(jù)睪丸內(nèi)不同細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)的有無進(jìn)行鑒定的RT-PCR及免疫熒光染色等。福爾根染色法、標(biāo)志性基因的RT-PCR和免疫熒光染色是較常用的未成熟SCs鑒定方法[24-25]。本試驗(yàn)通過對所分離細(xì)胞進(jìn)行福爾根染色、標(biāo)志性基因RT-PCR以及免疫熒光染色，證明所分離細(xì)胞為未成熟SCs，且純度較高，可滿足下一步試驗(yàn)需求。

綜上所述，本試驗(yàn)成功分離了新生中國西門塔爾牛未成熟SCs，分離方法簡單易行，所得細(xì)胞形態(tài)均勻，生長狀態(tài)良好，純度較高，對新生牛睪丸未成熟SCs的相關(guān)研究有良好的借鑒意義，可為其他物種的未成熟SCs的分離培養(yǎng)鑒定提供參考，也為豐富中國西門塔爾牛精子生成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證提供了依據(jù)。