馬鴻程，熊顯榮，海 卓，閔星宇，郝振宇，李 鍵

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)主要分布于我國(guó)海拔3 000 m 以上的高原地區(qū)，其對(duì)低氧惡劣生存環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，是當(dāng)?shù)啬撩裆a(chǎn)生活的重要資源之一。然而牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)緩慢，嚴(yán)重限制當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展，其主要原因在于牦牛性成熟晚、繁殖周期長(zhǎng)，繁殖性能較普通黃牛低下[1]。因此，開(kāi)展牦牛繁殖方面的研究對(duì)豐富我國(guó)遺傳資源多樣性以及提高當(dāng)?shù)啬撩竦纳钏骄哂兄匾膬r(jià)值。

卵巢是雌性牦牛重要的生殖器官，主要支持卵泡發(fā)育以及卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟[2]。包括顆粒細(xì)胞在內(nèi)的多種體細(xì)胞通過(guò)間隙連接，在各種激素、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子及卵泡內(nèi)外環(huán)境的共同作用下直接或間接的參與卵泡發(fā)育[3]。與顆粒細(xì)胞中直接調(diào)節(jié)類(lèi)固醇生成進(jìn)而參與卵泡發(fā)育的相關(guān)分子相比，表觀遺傳通過(guò)間接方式在卵泡發(fā)育過(guò)程中起著必要的調(diào)控作用[4]。組蛋白賴氨酸甲基化修飾作為重要的表觀遺傳修飾方式之一，通過(guò)組蛋白甲基化酶(HMTs)和去甲基化酶(HDMs)相互協(xié)調(diào)作用于氨基酸殘基特定位點(diǎn)。組蛋白去甲基化酶家族由大約24個(gè)基因組成，可分為7個(gè)功能不同的亞家族。KDM4B是KDM4/JMJD2亞家族成員，該家族有KDM4A～KDM4E 5個(gè)成員[5]。KDM4B蛋白結(jié)構(gòu)與KDM4A、KDM4C相似，均包含1個(gè)JmjC結(jié)構(gòu)域、1個(gè)JmjN結(jié)構(gòu)域、2個(gè)植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)和2個(gè)Tudor結(jié)構(gòu)域，其中JmjC結(jié)構(gòu)域的酶功能依賴于α-酮戊二酸(α-KG)、Fe(Ⅱ)和分子氧作為去甲基化反應(yīng)的輔因子，而JmjN結(jié)構(gòu)域可以作為二聚體結(jié)構(gòu)域并提供結(jié)構(gòu)完整性[6-7]。牦牛KDM4B基因共編碼1 116個(gè)氨基酸[8]，與KDM4亞家族的其他成員一樣，KDM4B可以將二甲基(me2)和三甲基(me3)賴氨酸脫甲基為單甲基(mel)狀態(tài)，對(duì)組蛋白殘基H3K9me3、H3K9me2、H3K36me3、H3K36me2、H4K20me2和H1.4K26me3均具有催化活性，其中H3K9me2/3是KDM4B的首選底物[9-10]。KDM4B在哺乳動(dòng)物各組織器官中廣泛表達(dá)，尤其在卵巢、睪丸等生殖器官中高表達(dá)[11]，研究發(fā)現(xiàn)KDM4B表達(dá)量在精子發(fā)生前增加同時(shí)H3K9me3顯著減少[12]；另外KRIEG等[13]研究表明，卵泡細(xì)胞中KDM4B mRNA及蛋白表達(dá)與患者能否成功體外受精相關(guān)。提示KDM4B參與生殖過(guò)程調(diào)控。

目前關(guān)于KDM4B基因的研究主要集中在前列腺癌[14]、乳腺癌[15]等癌癥方面，在卵巢組織及其功能中的研究較少。而作為重要的去甲基化酶之一，KDM4B是否參與牦牛卵泡發(fā)育調(diào)控仍未知。因此，本研究以牦牛卵巢為對(duì)象進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分析KDM4B蛋白在卵泡發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)定位，同時(shí)進(jìn)行牦牛卵泡直徑大小與卵母細(xì)胞成熟率及卵泡細(xì)胞(卵母細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞及壁層顆粒細(xì)胞)中KDM4B mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析，為深入研究KDM4B基因在調(diào)控卵巢卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑Trizol Reagent、Single Cell-to-CTTMKit微量RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)由南京諾唯贊提供；0.5%透明質(zhì)酸酶(0.5 g透明質(zhì)酸酶粉末、100 mL Medium199)、卵母細(xì)胞成熟液OM培養(yǎng)液(10%胎牛血清、Medium 199培養(yǎng)基)均購(gòu)自賽默飛公司；1 mg/L促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)、1 mg/L促黃體素(luteinizing hormone,LH)購(gòu)自Vetoquinol公司；1 mg/L 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)；0.02 g/L丙酮酸鈉(C3H3NaO3)和0.03 g/L谷氨酰胺(glutamine,Gln) 均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 卵巢樣本采集卵巢樣本采自四川省廣漢市屠宰場(chǎng)。3～5歲健康雌性牦牛(n=9)，屠宰后立即無(wú)菌采集卵巢組織，用含有雙抗(80 mg/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)的生理鹽水將采集到的卵巢沖洗干凈并隨機(jī)分為2組，1份用4%多聚甲醛固定液固定(用于后續(xù)免疫組織化學(xué))，另1份投入保溫瓶(含37℃生理鹽水、雙抗)中于3 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用37℃生理鹽水將卵巢沖洗數(shù)遍，根據(jù)卵泡直徑大小將卵泡分為大卵泡組(≥7 mm)、中卵泡組(3.0～6.9 mm)、小卵泡組(≤2.9 mm)，共3組。用12號(hào)針頭注射器抽取卵泡液置于90 mm平皿，在體視顯微鏡下按組收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulus-oocyte complex,COCs)，部分在卵母細(xì)胞成熟液中沖洗數(shù)遍，0.5%透明質(zhì)酸酶脫顆粒后分別收集卵母細(xì)胞(每組15枚)和卵丘顆粒細(xì)胞，其余COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。各組卵泡液離心后得到卵泡壁層顆粒細(xì)胞，用PBS洗滌數(shù)次后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 牦牛卵巢組織中KDM4B的定位及表達(dá)取出固定于4%多聚甲醛固定液中的卵巢組織進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)KDM4B蛋白表達(dá)及定位。PBS洗凈固定液后進(jìn)行浸蠟包埋制作成石蠟切片。染色前將切片置于60℃恒溫箱烘烤1～2 h后，依次使用二甲苯和乙醇脫蠟(6 min，3次)，然后蒸餾水洗2次各5 min；3%H2O2于室溫中避光孵育30 min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶；再用pH7.4的PBS沖洗3遍后用5%胎牛血清封閉，滴加多克隆兔抗KDM4B抗體(BIOSS公司，100倍稀釋)4℃孵育過(guò)夜。PBS重復(fù)沖洗2次各5 min，后加多聚化山羊抗兔IgG于37℃孵育90 min；DAB(PBS 1 000 μL、DAB儲(chǔ)備液20 μL、3%H2O25 μL)顯色10～15 min；室溫下蘇木精復(fù)染30 s后進(jìn)行脫水及透明，中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下觀察拍照。以褐色或棕褐色判定為陽(yáng)性細(xì)胞，顏色越深指示蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

1.4 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)在體視顯微鏡下選取結(jié)構(gòu)緊密、細(xì)胞質(zhì)均勻無(wú)皺縮，卵丘細(xì)胞致密的COCs，并用提前在培養(yǎng)箱中平衡10 h的OM培養(yǎng)液清洗2次。將包含GV期卵母細(xì)胞的COCs轉(zhuǎn)入平衡10 h的l mL OM成熟液中置于飽和濕度100%、二氧化碳5%的38.5℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)24 h后用0.5%透明質(zhì)酸酶脫顆粒，觀察第1極體排出率(以此標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟)。

1.5 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄收集的卵母細(xì)胞嚴(yán)格按照Single Cell-to-CTTMKit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，保存于―20℃?zhèn)溆?。將卵丘顆粒細(xì)胞及壁層顆粒細(xì)胞嚴(yán)格按照Trizol法說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，核酸濃度儀檢測(cè)其濃度和D值后，選擇D值在1.8～2.0的RNA作為模板，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank所公布牦牛KDM4B基因的mRNA序列(MH510242.1)及GAPDH mRNA序列(AC-000162.1)，利用NCBI(Primer-BLAST在線工具包)設(shè)計(jì)熒光定量引物，由南京金斯瑞生物科技公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.7 牦牛KDM4B 基因在卵泡細(xì)胞中的表達(dá)以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR方法檢測(cè)牦牛不同大小卵泡中卵母細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞及壁層顆粒細(xì)胞KDM4B mRNA的表達(dá)。將cDNA模板質(zhì)量濃度調(diào)整一致(40 mg/ L)，以保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。反應(yīng)體系為15 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至15 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。引物見(jiàn)表1，重復(fù)3次。

表1 引物信息

1.8 數(shù)據(jù)分析每組試驗(yàn)重復(fù)3次，熒光定量結(jié)果用2-△△Ct均一化處理，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，ANOVA顯著性差異分析。P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 KDM4B蛋白在牦牛卵巢組織中的表達(dá)與定位采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)KDM4B蛋白在牦牛卵泡發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)及定位。結(jié)果顯示，KDM4B蛋白在牦牛各發(fā)育時(shí)期卵泡中均有表達(dá)(圖1)。以褐色或棕褐色判定為陽(yáng)性表達(dá)，主要見(jiàn)于牦牛原始卵泡(圖1A)、初級(jí)卵泡(圖1B)、次級(jí)卵泡(圖1C)、三級(jí)卵泡(圖1D)以及優(yōu)勢(shì)卵泡(圖1E,F)，其中優(yōu)勢(shì)卵泡中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)KDM4B蛋白主要定位于卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞(GC)，而卵泡膜細(xì)胞(TC)中表達(dá)量較少。

A.原始卵泡(×100)；B.初級(jí)卵泡(×80)；C.次級(jí)卵泡(×80)；D.三級(jí)卵泡(×50)；E.優(yōu)勢(shì)卵泡(×50)；F.E的局部放大(×100);GC.顆粒細(xì)胞；TC.膜細(xì)胞

2.2 卵泡大小與卵母細(xì)胞成熟率關(guān)聯(lián)性分析對(duì)各組卵泡中卵母細(xì)胞分別進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，每組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)并統(tǒng)計(jì)成熟率。結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展能力在小卵泡時(shí)期最差，中卵泡時(shí)期最強(qiáng)，而大卵泡中部分卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞致密度不如中卵泡時(shí)期。卵母細(xì)胞體外成熟率隨卵泡發(fā)育呈顯著上升趨勢(shì)，大卵泡組成熟率為91.30%、中卵泡組成熟率為85.77%、小卵泡組成熟率為63.51%。其中大卵泡組、中卵泡組成熟率顯著高于小卵泡組(P<0.05)，但大卵泡、中卵泡組間成熟率差異不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 卵母細(xì)胞成熟率

2.3 牦牛不同發(fā)育階段卵泡細(xì)胞中KDM4B mRNA表達(dá)分析以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR方法檢測(cè)不同發(fā)育階段牦牛卵泡卵母細(xì)胞及其相對(duì)應(yīng)卵丘顆粒細(xì)胞、壁層顆粒細(xì)胞中KDM4B基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，KDM4B mRNA在牦牛不同發(fā)育階段卵泡細(xì)胞中呈動(dòng)態(tài)表達(dá)(圖2)。隨著卵泡發(fā)育，卵母細(xì)胞中KDM4B基因表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且中卵泡、大卵泡組卵母細(xì)胞中表達(dá)量顯著低于小卵泡組(P<0.05)，但它們兩組間差異不顯著(P>0.05)；不同組別卵泡中卵丘顆粒細(xì)胞與壁層顆粒細(xì)胞KDM4B基因表達(dá)量變化規(guī)律基本一致，即表達(dá)量隨卵泡發(fā)育程度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，其中，中卵泡、大卵泡組2種細(xì)胞中KDM4B表達(dá)量均極顯著高于小卵泡組(P<0.01)，同時(shí)以各組別壁層顆粒細(xì)胞中表達(dá)量作為參照，卵丘顆粒細(xì)胞中表達(dá)量約為同時(shí)期壁層顆粒細(xì)胞中的2倍(P<0.01)。

圖2 牦牛不同發(fā)育階段卵泡細(xì)胞中KDM4B mRNA的表達(dá)水平

3 討論

核小體被認(rèn)為是染色質(zhì)的基本重復(fù)單位，是由組蛋白H2A、H2B、H3、H4及DNA組成的八聚體。組蛋白通過(guò)包括甲基化在內(nèi)的組蛋白尾部翻譯后修飾方式來(lái)調(diào)節(jié)DNA在轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的功能。組蛋白賴氨酸甲基化是一個(gè)既能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活又能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制的動(dòng)態(tài)過(guò)程，在表觀遺傳中起著不可或缺的作用。研究表明，組蛋白去甲基化在DNA損傷[16]、造血干細(xì)胞維持[17]、脂肪代謝[18]及葡萄糖代謝[19]等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時(shí)，去甲基化酶在生殖調(diào)控過(guò)程中扮演著重要的角色，如KDM1A通過(guò)在顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞中的差異表達(dá)對(duì)卵泡發(fā)育起正向調(diào)控作用[20]。但目前關(guān)于KDM4B在雌性牦牛生殖調(diào)控中的作用研究國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。因此，探索KDM4B基因在牦牛卵泡發(fā)育中的表達(dá)模式對(duì)進(jìn)一步研究組蛋白去甲基化在牦牛生殖中的作用機(jī)制具有重要意義。

本試驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了KDM4B蛋白在牦牛卵泡發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)及定位，發(fā)現(xiàn)從原始卵泡到優(yōu)勢(shì)卵泡的各發(fā)育階段中，KDM4B蛋白均有表達(dá)，其主要定位于卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞，且表達(dá)強(qiáng)度隨著卵泡發(fā)育增加，發(fā)育至優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。KRIEG等[13]對(duì)體外受精患者的卵巢進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KDM4B蛋白主要定位于各發(fā)育階段卵泡中的卵母細(xì)胞、壁層顆粒細(xì)胞(GCs)及卵丘顆粒細(xì)胞(CCs)，且各時(shí)期卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量高于其他卵泡細(xì)胞，這種動(dòng)態(tài)的差異表達(dá)與卵母細(xì)胞能力密切相關(guān)。本試驗(yàn)牦牛卵巢中KDM4B蛋白表達(dá)模式與其研究結(jié)果基本一致，提示KDM4B蛋白同樣在牦牛卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

卵泡發(fā)育起始于胎兒時(shí)期，這是一個(gè)連續(xù)的、選擇性的過(guò)程，直到初情期后部分卵母細(xì)胞在卵泡內(nèi)外環(huán)境共同作用下開(kāi)始逐漸成熟并排卵[21-22]。卵泡發(fā)育程度以及顆粒細(xì)胞增殖分化對(duì)卵母細(xì)胞成熟率至關(guān)重要。本試驗(yàn)首先對(duì)獲取于牦牛不同直徑卵泡中的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著卵泡發(fā)育進(jìn)程卵母細(xì)胞成熟率明顯上升，且小卵泡組成熟率顯著低于中卵泡組和大卵泡組。原因可能是成熟卵泡細(xì)胞中mRNA及蛋白儲(chǔ)存水平更高，顆粒細(xì)胞等卵泡細(xì)胞通過(guò)縫隙連接蛋白為卵母細(xì)胞提供更加良好的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)其發(fā)育成熟[3]。研究發(fā)現(xiàn)KDM4B通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/TGF-β等)的表達(dá)來(lái)激活通路，在顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞相互調(diào)控中起著重要作用，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育成熟[23-24]。此外，KDM4B是雌激素依賴性基因表達(dá)的重要因素，同時(shí)有腔卵泡CCs中雌激素受體β(ER-β)表達(dá)量與卵母細(xì)胞成熟率呈正相關(guān)[25-26]。由此可知KDM4B可能對(duì)卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育具有一定的影響。

為進(jìn)一步探究KDM4B基因在這一過(guò)程中的作用，本試驗(yàn)運(yùn)用RT-qPCR方法檢測(cè)了各組卵泡細(xì)胞中KDM4B mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明其mRNA在各組卵泡卵母細(xì)胞、CCs及GCs中均有表達(dá)。其中卵母細(xì)胞中KDM4B mRNA表達(dá)趨勢(shì)與卵母細(xì)胞體外成熟率相反，即隨卵泡發(fā)育程度表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，這可能與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程恢復(fù)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)隨著卵泡發(fā)育進(jìn)程，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，P53的表達(dá)在這一過(guò)程中逐漸升高[27]，而LI等[28]發(fā)現(xiàn)干擾KDM4B表達(dá)會(huì)激活胃癌細(xì)胞中的P53，推測(cè)KDM4B作為P53的負(fù)調(diào)節(jié)因子而促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟。因此卵母細(xì)胞中KDM4B表達(dá)隨卵泡發(fā)育而下降，減數(shù)分裂恢復(fù)使大卵泡中卵母細(xì)胞成熟率最高。隨著卵泡腔的形成，顆粒細(xì)胞逐漸分化形成直接包繞在卵母細(xì)胞周?chē)腃Cs及緊貼著腔壁的GCs[29]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組卵泡CCs、GCs中KDM4B表達(dá)規(guī)律一致，均隨卵泡發(fā)育呈明顯的上升趨勢(shì)。研究已證實(shí)顆粒細(xì)胞表面的雌激素受體(ER)及雄激素受體(AR)分別與雌激素和雄激素結(jié)合，對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖分化起正向調(diào)控作用。同時(shí)KDM4B是ER信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的主要調(diào)節(jié)劑，其還通過(guò)抑制AR泛素化來(lái)增強(qiáng)AR蛋白的穩(wěn)定性[25,30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在小鼠不同發(fā)育階段顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)量隨卵泡發(fā)育增強(qiáng)[31]。同時(shí)POLLARD等[32]研究表明KDM4B是由HIF-1α從位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約500 bp的缺氧反應(yīng)原件(HRE)直接誘導(dǎo)的。因此，顆粒細(xì)胞中KDM4B在核激素受體及HIF-1α的作用下調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖分化，隨顆粒細(xì)胞增多進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟。此外本研究發(fā)現(xiàn)，各組CCs中KDM4B相對(duì)表達(dá)量均高于同組GCs。研究表明與GCs相比，CCs在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中提供了更多的營(yíng)養(yǎng)，CCs缺失會(huì)嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的成熟[33-34]。推測(cè)KDM4B在CCs中表達(dá)量更高是由于其在CCs與卵母細(xì)胞間的分子交換過(guò)程中起著更加關(guān)鍵的作用，具體調(diào)節(jié)方式有待進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上，KDM4B對(duì)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞有著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂及顆粒細(xì)胞增殖分化進(jìn)而參與卵泡發(fā)育調(diào)控。

本試驗(yàn)首次通過(guò)免疫組化法及RT-qPCR法檢測(cè)了KDM4B在牦牛卵泡發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)。結(jié)果顯示,KDM4B蛋白在牦牛卵泡各發(fā)育階段均有表達(dá)，其中優(yōu)勢(shì)卵泡表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)。不同大小卵泡卵母細(xì)胞中KDM4B mRNA表達(dá)趨勢(shì)與體外成熟率相反，隨著卵泡發(fā)育其表達(dá)量明顯下降。顆粒細(xì)胞中KDM4B mRNA表達(dá)隨卵泡發(fā)育呈上升趨勢(shì)。表明KDM4B基因參與卵泡發(fā)育調(diào)控，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟及顆粒細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。