馮 爽，張雙翼，李茜如，趙佳敏，鞏志國，劉 博

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

子宮內(nèi)膜位于子宮內(nèi)壁，是由單層上皮細(xì)胞覆蓋在間質(zhì)基質(zhì)上構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[1]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)可參與血管生成、子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和子宮內(nèi)膜生長修復(fù)過程[2-3]。COX-2過表達(dá)可加速子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，而COX-2抑制劑可減緩此過程[4-5]。COX-2可導(dǎo)致花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)，其中包括列腺素F2α(prostaglandin F2α，PGF2α)在內(nèi)的多種前列腺素的共同前體。在家畜子宮內(nèi)膜生長修復(fù)過程中，尚不清楚每種前列腺素所發(fā)揮的具體功能。

不同動物在發(fā)情期或妊娠早期，子宮內(nèi)膜生長修復(fù)與PGF2α分泌、PGF2α合成酶(PGF2αsynthase，PGFS)和PGF2α受體(prostaglandin F2αreceptor，PTGFR)表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系[6-8]。PGF2α的濃度在月經(jīng)期呈周期性變化，而PTGFR的表達(dá)在增殖期的人子宮內(nèi)膜中呈上升趨勢[9]。此外，PGF2α-PTGFR通路的激活可加速子宮內(nèi)膜腫瘤的生長[10]。眾所周知，雌二醇(estradiol，E2)對子宮內(nèi)膜的生長和修復(fù)具有促進(jìn)作用。有研究證明，17β-雌二醇可刺激家畜子宮內(nèi)膜或輸卵管中PGF2α、PGFS和PTGFR的合成或表達(dá)[8,11]。然而，PGF2α-PTGFR通路在子宮內(nèi)膜生長修復(fù)中的具體作用仍不清楚。

在本試驗中，通過實(shí)時熒光定量PCR、Western blot和組織免疫熒光染色等方法分析了在PGF2α-PTGFR通路被激活后，對體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中參與子宮內(nèi)膜修復(fù)的一系列生長因子，包括結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)表達(dá)的影響。此外，分析了PGF2α-PTGFR通路對奶牛子宮內(nèi)膜組織中能夠代表細(xì)胞發(fā)生增殖的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)的影響。上述試驗可為闡明前列腺素類化合物在奶牛子宮內(nèi)膜組織修復(fù)中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品及抗體胎牛血清(FBS)購自ExCell Biology公司；DMEM/F-12購自GIBCO公司；氟前列醇(fluprostenol，PTGFR激動劑，可激活PGF2α-PTGFR通路)購自Cayman Chemical公司?？俁NA提取劑量試劑盒購自Axygen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；實(shí)時熒光定量PCR試劑(FastStart Universal SYBR Green Master)購自Roche Applied Science公司。組織總蛋白提取試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自Thermo Scientific公司；SDS-PAGE樣品上樣緩沖液購自Beyotime公司。

兔抗CTGF抗體購自GeneTex公司；鼠抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體、兔抗TGF-β1抗體、鼠抗β-actin抗體均購自Abcam公司；兔抗VEGFA抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗FGF-2抗體購自NovusBio公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗均購自Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor 488偶聯(lián)山羊抗鼠IgG H&L抗體、小鼠IgG同型對照(isotype)抗體均購自Abcam公司。使用的引物由Invitrogen公司合成。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)按照本課題組先前報道的方法進(jìn)行[12-13]。在屠宰場收集處于發(fā)情前期的健康荷斯坦奶牛雙側(cè)子宮角，置于冰上保存，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗室做進(jìn)一步處理。首先，用含100 IU/mL青鏈霉素和2.5 mg/L兩性霉素B的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗組織3次后置于4℃保存1 h。然后，在無菌條件下分離各個子宮角，使用彎剪刀和眼科鑷子縱向切開子宮角，將子宮內(nèi)膜組織取出。將子宮內(nèi)膜組織再分為直徑約2 mm、厚度約1 mm的小塊，每孔8塊組織，放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入5 mL含有20% FBS、100 IU/mL青鏈霉素和2.5 mg/L兩性霉素B的培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)5 d后待處理。

1.3 樣品處理將培養(yǎng)5 d的子宮內(nèi)膜組織塊分組。在濃度梯度處理試驗中，使用不同終濃度(10-9～10-5mol/L)的氟前列醇處理組織，并設(shè)置對照試驗組，處理后提取mRNA(處理后4 h)和總蛋白(處理后12 h用于生長因子蛋白檢測，處理后24 h用于PCNA蛋白表達(dá)檢測)，通過實(shí)時熒光定量PCR、Western blot分析生長因子和PCNA的表達(dá)情況。為了檢測氟前列醇處理的時間依賴效應(yīng)，使用終濃度為10-7mol/L的氟前列醇處理奶牛子宮內(nèi)膜組織2～36 h，并設(shè)置對照試驗組，在相應(yīng)處理時間點(diǎn)分別提取mRNA和總蛋白，分析生長因子和PCNA的表達(dá)情況。使用終濃度為10-7mol/L的氟前列醇處理奶牛子宮內(nèi)膜組織24 h，并設(shè)置對照試驗組，隨后使用OCT冰凍切片包埋劑進(jìn)行包埋，并置于-80℃保存，通過組織免疫熒光染色分析PCNA在組織中的表達(dá)情況。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)總mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量RT-PCR反應(yīng)按照說明書進(jìn)行操作。從奶牛子宮內(nèi)膜組織提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，步驟如下：在ABI ViiA 7實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(applied biosystems)上，50℃ 2 min，1個循環(huán)；95℃ 10 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環(huán)。使用的引物見表1。根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)的方法，以持家基因β-actin作為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt-ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin)的計算方法進(jìn)行目的基因表達(dá)的統(tǒng)計與分析[14]。

表1 實(shí)時熒光定量反應(yīng)引物序列

1.5 Western blot分析在本試驗中使用Western blot方法對奶牛子宮內(nèi)膜組織樣本中蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析[13]。組織總蛋白的提取、濃度的測定及蛋白變性按說明書進(jìn)行操作。將從試驗組和對照組樣品中提取的總蛋白進(jìn)行變性后，置于―80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。配?2% SDS-PAGE分離凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每孔總蛋白加樣量為30 μg。電泳程序如下：濃縮膠80 V電泳15 min，分離膠120 V電泳90 min。在40 V條件下進(jìn)行膜轉(zhuǎn)印30 min((Trans-Blot SD，Bio-Rad)。電泳完成后使用StartingBlockTM封閉液(Thermo Scientific)封閉膜1 h，然后在4℃條件下孵育一抗14 h。一抗稀釋比例如下：CTGF、FGF-2、TGF-β1、PCNA和β-actin一抗稀釋比例均為1∶1 000；VEGFA一抗稀釋比例均為1∶250。一抗孵育完成后，用含Tween-20的Tris緩沖液(TBST)洗膜，室溫孵育二抗(1∶8 000稀釋)1 h。然后用TBST沖洗膜，使用Supersignal west femto化學(xué)發(fā)光底物(Thermo Scientific)和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE Image-Quant-RT)進(jìn)行圖像的采集，根據(jù)得到的圖像通過ImageJ(National Institutes of Health)軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.6 免疫熒光分析按照本課題組先前報道的方法對奶牛子宮內(nèi)膜組織樣本中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫熒光染色[13]。將處理后的子宮內(nèi)膜組織冰凍切片(厚度6 μm)在室溫下解凍15 min，用預(yù)冷的丙酮固定10 min。然后切片用預(yù)冷的PBS沖洗，并用10%山羊血清室溫封閉1 h。切片使用抗PCNA抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。孵育完成后使用PBS洗滌3次，隨后使用Alexa Fluor 488偶聯(lián)山羊抗鼠IgG H&L抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h。使用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-800)檢測熒光信號，并通過ImageJ軟件計算熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的氟前列醇對體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF、FGF2、TGF-β1和VEGFA表達(dá)的影響使用不同終濃度(10-9～10-5mol/L)的PTGFR激動劑氟前列醇處理體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織后，分別通過實(shí)時熒光定量PCR和Western blot方法分析組織中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA mRNA(處理4 h后)和蛋白(處理12 h后)的表達(dá)水平。試驗結(jié)果表明(圖1A-D)，終濃度為10-7mol/L和更高終濃度的氟前列醇可顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF、TGF-β1和VEGFA mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而終濃度為10-8mol/L和更高濃度的氟前列醇可顯著上調(diào)FGF-2 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。此外，終濃度為10-7mol/L的氟前列醇可顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜組織中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA蛋白的表達(dá)(P<0.05)，與mRNA表達(dá)檢測的結(jié)果基本一致。因此，在后續(xù)研究中，終濃度為10-7mol/L的氟前列醇可用于開展PTGFR被激活后上述生長因子表達(dá)的時間效應(yīng)試驗。

*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。下同

2.2 終濃度為10-7mol/L的氟前列醇對體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA表達(dá)的影響終濃度為10-7mol/L的PTGFR激動劑氟前列醇處理體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織不同時間后(4～36 h)，分別通過實(shí)時熒光定量PCR和Western blot方法分析組織中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA mRNA以及蛋白的表達(dá)情況。試驗結(jié)果表明，CTGF mRNA的表達(dá)量在氟前列醇處理2,4 h后出現(xiàn)上升，處理36 h后亦出現(xiàn)上升，而CTGF蛋白表達(dá)量在處理4～36 h后出現(xiàn)上升，18 h達(dá)到峰值(圖2A)。氟前列醇可上調(diào)子宮內(nèi)膜組織中FGF-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，且其表達(dá)在所有處理時間點(diǎn)均維持在較高水平；FGF-2 mRNA的表達(dá)在處理4 h后達(dá)到高峰，F(xiàn)GF-2蛋白的表達(dá)在處理8 ，12 h后達(dá)到高峰；(圖2B)。氟前列醇可誘導(dǎo)TGF-β1 mRNA(處理4，12，24和36 h 后)和蛋白(處理12～36 h后)表達(dá)的上調(diào)(圖2C)。在處理8 h后，氟前列醇誘導(dǎo)的VEGFA mRNA表達(dá)恢復(fù)至正常水平，但處理后24～36 h，VEGFA mRNA的表達(dá)水平再次上升；VEGFA蛋白表達(dá)水平從處理12～36 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖2D)。因此，終濃度為10-7mol/L的氟前列醇可在特定的處理時間點(diǎn)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA的表達(dá)量上調(diào)。

圖2 終濃度為10-7 mol/L的PTGFR激動劑氟前列醇處理不同時間后(4 ～36 h)對奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF(A)、FGF-2(B)、TGF-β1(C)和VEGFA(D)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3 氟前列醇對體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA表達(dá)的影響使用不同終濃度(10-9～10-5mol/L)的PTGFR激動劑氟前列醇處理體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織24 h后，通過Western blot檢測組織中PCNA蛋白的表達(dá)情況。試驗結(jié)果表明，10-7mol/L和更高終濃度的氟前列醇可顯著上調(diào)PCNA蛋白的表達(dá)(圖3A)。因此，在后續(xù)試驗中，終濃度為10-7mol/L的氟前列醇可用于開展PTGFR被激活后奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA表達(dá)的時間效應(yīng)試驗。試驗結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織在使用終濃度為10-7mol/L的氟前列醇處理后，PCNA蛋白的表達(dá)在處理后12～36 h內(nèi)顯著上升(圖3A)。同時，免疫熒光染色試驗表明，在使用氟前列醇處理24 h后，奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA的表達(dá)顯著上升(圖3B)，與Western blot檢測結(jié)果一致。因此，PTGFR激動劑氟前列醇可上調(diào)奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA的表達(dá)。

圖3 PTGFR激動劑氟前列醇對對奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA蛋白表達(dá)的影響

3 討論

PGF2α廣泛分布于各組織器官中，并具有多種生物活性。近年來，PGF2α調(diào)控生長因子表達(dá)、細(xì)胞增殖和組織生長的能力已被證實(shí)。例如，PGF2α可刺激骨骼肌細(xì)胞的增殖，而且該過程是母羊囊狀濾泡生長所必需的[15]。此外，PGF2α在豬著床期間具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成的作用[16]。值得注意的是，牛子宮內(nèi)膜在發(fā)情期和妊娠早期，PGF2α分泌模式與子宮內(nèi)膜生長呈正相關(guān)，但PGF2α分泌與子宮內(nèi)膜生長之間的關(guān)系尚不清楚。本課題組在前期研究工作中已經(jīng)成功建立了奶牛子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)方法[12]。本試驗結(jié)果表明，在奶牛子宮內(nèi)膜組織中，PTGFR激活后可誘導(dǎo)一系列對子宮內(nèi)膜生長所必須的生長因子和細(xì)胞增殖因子的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了PGF2α的分泌參與子宮內(nèi)膜組織生長的可能性。

子宮內(nèi)膜狀態(tài)的改變是由E2、黃體酮等類固醇激素，以及由子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞合成和釋放的CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA等細(xì)胞因子直接或間接決定的。CTGF是重要的子宮內(nèi)膜生長調(diào)控因子。月經(jīng)期、增殖期與分泌期相比，人子宮內(nèi)膜組織的腺上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中CTGF的表達(dá)量顯著上升[17]。本試驗表明，PTGFR激動劑氟前列醇可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜組織中CTGF表達(dá)的上調(diào)。該結(jié)果與先前研究報道的人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在使用PGF2α處理后，其CTGF表達(dá)顯著升高的結(jié)果是一致的[17]。FGF-2及其受體在牛子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)[18]。FGF-2能夠促進(jìn)豬子宮內(nèi)膜組織中子宮細(xì)胞的增殖、分化和血管生成過程[19]。本試驗中，使用PTGFR激動劑氟前列醇處理后，F(xiàn)GF-2的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，表明在奶牛子宮內(nèi)膜中，F(xiàn)GF-2的表達(dá)可能受到PGF2α-PTGFR通路激活的調(diào)控。TGF-β蛋白及其受體在促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮了重要作用[20]。此外，在發(fā)情期內(nèi)，TGF-β1的高表達(dá)可能通過調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞運(yùn)動、增殖、凋亡和分化而在發(fā)情期內(nèi)參與子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的重建[21-22]。本試驗結(jié)果表明，PGF2α-PTGFR通路的激活可上調(diào)TGF-β1在奶牛子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。VEGF是血管生成的關(guān)鍵因子。在子宮內(nèi)膜組織修復(fù)中，子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)的上調(diào)是完成該過程的必要條件[23]。在本試驗中，PTGFR激動劑氟前列醇可誘導(dǎo)VEGFA的表達(dá)，表明PGF2α-PTGFR通路的激活可能通過誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜組織中VEGFA的表達(dá)促進(jìn)其修復(fù)。

除上述生長因子外，為分析和判斷PGF2α-PTGFR通路激活后奶牛子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞增殖的趨勢，本試驗亦檢測了組織中能夠代表細(xì)胞發(fā)生增殖的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況。試驗結(jié)果表明，PTGFR激動劑氟前列醇處理后，奶牛子宮內(nèi)膜組織中PCNA的表達(dá)水平顯著上升，表明PGF2α-PTGFR通路的激活對組織中的細(xì)胞增殖具有一定的誘導(dǎo)作用。該結(jié)果與生長因子表達(dá)的結(jié)果完全一致，進(jìn)一步說明PGF2α-PTGFR通路的激活可通過奶牛子宮內(nèi)膜組織中生長因子和PCNA表達(dá)，促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜組織的修復(fù)過程。

綜上所述，本試驗探討了一系列生長因子在奶牛子宮內(nèi)膜組織中對PTGFR激動劑處理的應(yīng)答情況。PTGFR激動劑氟前列醇對CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA的表達(dá)均具有上調(diào)作用，表明PGF2α-PTGFR通路的激活可能通過誘導(dǎo)生長因子的表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)過程。此外，前列腺素類化合物及其類似物具有作為子宮內(nèi)膜促修復(fù)藥物應(yīng)用的潛力，在獸醫(yī)臨床工作中可加以合理使用。然而，在目前的研究中，奶牛子宮內(nèi)膜組織中負(fù)責(zé)合成分泌這些生長因子的細(xì)胞類型尚未明確，尚需在未來的研究工作中進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。