張玳寧，于秀華，張 舒，段 銘*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院 人獸共患病研究所 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林大學 第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是近些年才發(fā)現(xiàn)的一種新的內(nèi)源性非編碼RNA，具有獨特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由前體mRNA反向剪接產(chǎn)生[1]。大約40年前，這些環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本被認為是mRNA剪接的副產(chǎn)物[2]，但隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)數(shù)以千計的circRNA。已有的研究結(jié)果表明，circRNA表達具有較高的組織特異性和發(fā)育階段特異性，且在基因表達調(diào)控中具有重要的生理功能[3]，在癌癥、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等生理病理進程中扮演了重要的角色。

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)，屬于正黏病毒科，單股負鏈RNA病毒，對人類及動物的生命健康具有重大危害，但是宿主編碼的circRNA在IAV與宿主細胞相互作用中的功能及其機制尚不清楚[4]。本實驗室前期基于基因芯片技術(shù)分析circRNA在IAV感染A549細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0070421的表達顯著上調(diào)[5]。本研究探討了hsa_circ_0070421在IAV感染過程中的表達及其功能，研究結(jié)果有助于認知circRNA在IAV與宿主相互作用中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑聚肌苷酸胞苷酸(Poly I：C)和大腸桿菌O55：B5的脂多糖(LPS)購自Sigma-Aldrich公司；Cisplatin購自MedChem Express公司；超純瓊脂糖凝膠(UltraPure Agarose)購自Invitrogen公司；抗IAV-M1抗體購自Abcam公司；抗β-actin抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 細胞培養(yǎng)A549和THP-1細胞在含有10%胎牛血清(FBS)(HyClone)和100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640(Corning)中培養(yǎng)；將MDCK、A172、Caco-2和SH-SY5Y細胞維持在含10% FBS的DMED(Corning)中培養(yǎng)，并置于37℃、4%CO2培養(yǎng)箱中生長。

1.3 病毒和病毒感染將流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)在11日齡雞胚尿囊腔中增殖。用PBS洗滌細胞，并用感染復數(shù)(MOI)=3的病毒與含有1 mg/L TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)基一起孵育1 h，吸附后，吸出上清液，將細胞培養(yǎng)指定的時間。

1.4 細胞處理A549細胞鋪24孔板，次日細胞密度達到60%～80%，分別加入LPS和Cisplatin，使其終質(zhì)量濃度分別為1 mg/L和10 μmol/L，24 h后提取總RNA。

1.5 質(zhì)粒、siRNA和轉(zhuǎn)染基于pHB-circBasic載體(HanBio)構(gòu)建hsa_circ_0070421的真核表達質(zhì)粒[5]。抑制hsa_circ_0070421表達的siRNA由上海吉瑪公司合成，序列為5′-GCUGCACAGGAUAACCACCTT-3′，根據(jù)Lipofectamine RNA-iMAX試劑(Invitrogen)說明書進行轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒和Poly I:C的轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine LTX reagent轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)使用說明書進行。以6 孔板為例：用250 μL Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將所需量轉(zhuǎn)染試劑稀釋、混勻后靜置5 min，用250 μL Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將所需要的質(zhì)?；騪oly I:C稀釋，混勻后靜置5 min，然后將處理好的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒1∶1混勻，靜置10 min后將混合液加入到培養(yǎng)板中，細胞置于CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 RNA的提取、實時熒光定量PCR(qPCR)和半定量RT-PCR使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄前42℃ 2 min反應(yīng)，去除基因組DNA。RNA反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 min。取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用FastStart Essential DNA Green Master(Roche)進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)程序：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。對于半定量RT-PCR，反應(yīng)條件：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。均以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為電壓100 V，10 min，在凝膠成像儀(UVP EC3 Imaging System)上觀察結(jié)果。

表1 PCR引物序列及擴增片段長度

1.7 空斑試驗將MDCK細胞以2.5×105個/孔的密度均勻鋪于12孔細胞培養(yǎng)板中，加入梯度稀釋的細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育2 h，棄掉上清，加入1%的超純瓊脂糖凝膠，在37℃、4%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，利用結(jié)晶紫進行活細胞染色，統(tǒng)計空斑數(shù)量，計算獲得病毒樣品的感染性滴度(PFU/mL)=(每孔平均空斑個數(shù)×病毒稀釋倍數(shù))/每孔病毒接種量(mL)。

1.8 蛋白提取和Western blot收集處理后的A549細胞并提取總蛋白，在10% SDS-PAGE凝膠中加樣電泳，每組含等量蛋白樣品。電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中進行封閉。按照抗體說明書制備一抗IAV-M1和β-actin，在4℃冰箱內(nèi)與膜孵育。二抗孵育后，利用 ECL化學發(fā)光顯色(Pierce)，通過 ECL 化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集信號，用 Image J 軟件對電泳圖進行灰度值的分析。

2 結(jié)果

2.1 IAV感染后宿主hsa_circ_0070421的表達顯著上調(diào)前期circRNA組學數(shù)據(jù)提示hsa_circ_0070421與IAV感染密切相關(guān)。用收斂引物和分散引物分別擴增cDNA和基因組中的hsa_circ_0070421，結(jié)果cDNA中的hsa_circ_0070421為環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖 1A)。取IAV感染不同時間點樣品用熒光定量PCR方法再次驗證，結(jié)果IAV感染A549細胞后宿主hsa_circ_0070421的表達隨感染時間的延長逐漸增加，在感染后24 h表達量最高(圖 1B)，而不同MOI 的IAV感染A549細胞后hsa_circ_0070421的表達與病毒感染劑量呈顯著正相關(guān)(圖 1C)，說明hsa_circ_0070421的表達與IAV感染復制密切相關(guān)。選取不同器官或組織來源的5種人源細胞系，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測其hsa_circ_0070421的表達水平。結(jié)果如圖 1D所示，hsa_circ_0070421在研究選取的細胞系中表達水平有所差異，除Caco-2外，其他4種細胞系中均可檢測到該circRNA的表達，且表達量高低與病毒M基因的表達呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，hsa_circ_0070421的表達即呈現(xiàn)出細胞類型的廣泛性，也兼具特異性，并且其表達量與IAV的感染復制密切相關(guān)。

A.收斂引物和分散引物擴增的hsa_circ_0070421電泳圖；B.IAV(PR8)感染A549細胞不同時間對hsa_circ_0070421表達的影響； C.不同MOI 的IAV(PR8)感染A549細胞后24 h對hsa_circ_0070421表達的影響；D.不同細胞系感染IAV(PR8) 24 h后 hsa_circ_0070421的表達。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。下同

2.2 Poly I:C和IFN有效誘導hsa_circ_0070421表達為了研究IAV感染后hsa_circ_0070421表達的誘因，分別使用聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid，Poly I:C)、干擾素-β(interferon，IFN-β)、細菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、凋亡誘導劑Cisplatin和血清饑餓法處理A549細胞,結(jié)果如圖2A所示，Poly I:C處理A549細胞后，hsa_circ_0070421的表達在12 h極顯著增加；IFN-β刺激A549細胞后，hsa_circ_0070421的表達隨時間的延長極顯著增加(圖 2B)；LPS刺激細胞后，hsa_circ_0070421表達的上調(diào)幅度遠小于Poly I:C和IFN-β的刺激(圖2C)；Cisplatin(10 μmol/L)和血清饑餓處理細胞后，hsa_circ_0070421表達水平不受影響(圖 2D)。這些數(shù)據(jù)表明，IAV復制過程中產(chǎn)生的大量病毒RNA及其所激活的Ⅰ型IFN相關(guān)的抗病毒天然免疫應(yīng)答可能是hsa_circ_0070421表達的主要誘因。

A.Poly I:C轉(zhuǎn)染A549細胞不同時間后hsa_circ_0070421的表達；B.IFN-β刺激A549細胞不同時間后hsa_circ_0070421的表達；C.LPS處理A549細胞不同時間后對hsa_circ_0070421的表達；D.Cisplatin和血清饑餓處理A549細胞24 h后hsa_circ_0070421的表達

2.3 hsa_circ_007042抑制IAV復制為了探究hsa_circ_0070421對IAV復制的影響，應(yīng)用過表達和用siRNA敲低hsa_circ_0070421的方法處理細胞，并在病毒mRNA、蛋白和病毒粒子水平上檢測hsa_circ_0070421對病毒復制的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，hsa_circ_0070421的過表達顯著抑制 IAV M基因和M1蛋白的表達，且病毒的感染滴度降低；反之，與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比，轉(zhuǎn)染hsa_circ_0070421 siRNA的A549細胞可促進IAV M基因和M1蛋白的表達復制，且病毒的感染滴度升高(圖3)。上述結(jié)果表明，hsa_circ_0070421具有抑制IAV復制的功能。

A.hsa_circ_0070421在mRNA水平對IAV復制的影響；B.hsa_circ_0070421在蛋白水平對IAV復制的影響；C.hsa_circ_0070421對IAV子代病毒粒子產(chǎn)生的影響

3 討論

1976年，人們首先在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了共價閉合的circRNA[6]，之后，研究人員又在動物細胞和真菌酵母中發(fā)現(xiàn)了circRNA[7-9]，但鑒于生物技術(shù)的局限性和結(jié)構(gòu)的特殊性，circRNA在當時被認為是RNA錯誤剪接或剪接過程中形成的副產(chǎn)物。直到2012年，SALZMAN等[10]對circRNA進行了比較全面系統(tǒng)的研究報道，人們才開始重新認識并深入研究這一類“生物暗物質(zhì)”。近年來，circRNA的生物學功能已成為生命科學領(lǐng)域研究的熱點之一。已有的相關(guān)研究表明，circRNA發(fā)揮生物學功能的作用機制豐富多樣，除了作為miRNA海綿起作用外，還可以調(diào)節(jié)mRNA可變剪接、作為翻譯的模板、調(diào)節(jié)rRNA和tRNA的生物發(fā)生和作為裝配蛋白質(zhì)復合物的支架[11]。值得注意的是，不同circRNA在特定疾病背景下異常表達，表明其與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，比如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝病和病原感染等。

近幾年，研究人員對宿主編碼circRNA在病毒感染宿主細胞過程中的作用也展開了相關(guān)的研究?；谛酒騌NA高通量測序技術(shù)，人們已經(jīng)研究了10余種病毒感染后宿主circRNA表達模式的改變，包括單純皰疹病毒1型、人巨細胞病毒、乙肝病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、馬立克病毒和J亞群禽白血病病毒等[12-18]。這些組學數(shù)據(jù)不僅證實病毒感染能改變宿主circRNA的表達模式，而且說明circRNA在病毒與宿主的相互作用中扮演重要的角色，既有可能是宿主抗病毒感染的工具，也有可能成為病毒重塑有利于自身復制的細胞內(nèi)微環(huán)境的利器。上述差異表達circRNA在病毒感染致病或宿主抗病毒應(yīng)答中的功能及其分子機制的研究尚未廣泛展開，亟待探究。

源于本實驗室前期組學數(shù)據(jù)的遴選結(jié)果，選擇差異表達顯著上調(diào)的hsa_circ_0070421作為研究目標。本研究首先從IAV感染后不同時間點、不同毒株和不同MOI多角度驗證IAV感染與宿主hsa_circ_0070421表達的關(guān)聯(lián)。在5種細胞系中檢測了hsa_circ_0070421的表達，結(jié)果顯示該circRNA廣泛表達于多種器官或組織來源的細胞中，但其生物學功能在不同細胞類型中可能不盡相同。隨后利用凋亡誘導劑和血清饑餓排除了hsa_circ_0070421表達上調(diào)與病毒感染時的其他細胞表型或極端的生理條件之間的關(guān)聯(lián)。Poly I:C是雙鏈RNA的類似物，是一種常用的Toll樣受體3激動劑和IFN誘導劑，可用來模擬RNA病毒復制過程中的病毒RNA中間體。Poly I:C和IFN-β的處理顯著誘導hsa_circ_0070421表達，表明該circRNA表達是病毒RNA在細胞內(nèi)累積并激活從模式識別受體到Ⅰ型IFN相關(guān)抗病毒免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，可能具有類似IFN刺激基因的功能。功能學試驗顯示hsa_circ_0070421能夠抑制IAV復制和增殖，更好地佐證了其是宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答的一員，但其抗病毒作用的分子機制尚需在后續(xù)的研究中進一步闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)和鑒定了hsa_circ_0070421抗IAV復制的新功能，研究結(jié)果豐富了對circRNA功能的理解，為探究IAV與宿主相互作用提供了新的視角。