馮玲玲，馮 進(jìn)，李春陽,

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.江蘇省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京 210014）

膠原蛋白是普遍存在于動物結(jié)締組織中的一類纖維狀蛋白，也是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的主要成分，占動物總蛋白的25%～30%[1]。它具有由三條肽鏈相互纏繞而成的三螺旋穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在維持組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性方面起著至關(guān)重要的作用。目前，研究人員已根據(jù)膠原蛋白的序列同源性和分子結(jié)構(gòu)將其分為29種類型（IXXIX型）[2-3]，其中，I型膠原蛋白在研究中最為常見，它含有3條α-鏈，組成方式一般為[α1(I)]2α2(I)或[α1(I)]3[4]。因其具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性以及低抗原性，而在食品、材料以及化妝品等領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用。目前，膠原蛋白的制備來源主要為陸生哺乳動物的皮膚和骨骼，但由于多種人畜共患病的爆發(fā)以及宗教信仰等問題，使得該種膠原蛋白在實際生產(chǎn)應(yīng)用中受到了極大的限制[5]。因此，許多研究人員開始將注意力集中在水生膠原蛋白上，例如鯛魚[6]、海參[7]、金槍魚[8]等，都已被認(rèn)為是天然膠原蛋白的提取來源。

海蜇是海蜇屬的統(tǒng)稱，目前普遍分布于熱帶、亞熱帶以及溫帶沿海地區(qū)。隨著人工繁育的成功，海蜇數(shù)量不斷增加，但由于其收獲期短、易腐敗，大多因并未得到及時處理而失去商品價值，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會影響。海蜇中蛋白質(zhì)含量約占干物質(zhì)的60%[9]，其中膠原蛋白為主要蛋白，占總蛋白的50%左右[10]。因此，海蜇可作為一種天然安全的膠原蛋白提取來源，極具開發(fā)價值。目前，國內(nèi)外對海蜇膠原蛋白的提取研究較多[11-13]，但對其結(jié)構(gòu)特性的相關(guān)研究比較少?；诖?，本研究采用胃蛋白酶從海蜇中提取膠原蛋白，并通過紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、圓二色譜等分析手段對海蜇膠原蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在提高海蜇的產(chǎn)品附加值，減少資源浪費，并為利用海蜇膠原蛋白進(jìn)一步制備出生物材料和活性肽提供有利的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙海蜇加工下腳料（Rhopilema esculentum Kishinouye） 江蘇海苑食品有限公司；胃蛋白酶（≥1200 U/g） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白Marker（11～245 kDa） SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液、羥脯氨酸含量檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；再生纖維素透析袋（50000 kDa） 上海源葉生物科技有限公司；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇、苯酚、三氯乙酸、正丁醇、尿素、石油醚、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250 以上試劑均為分析純。

FDU-1200真空冷凍干燥機 東京理化器械株式會社；Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；J-1500圓二色光譜儀 日本JASCO公司；AL104電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；PHS-2C pH計 上海智光儀器儀表公司；UV-6100紫外分光光度計 上海美普達(dá)儀器有限公司；JYSCZ2+垂直電泳槽、JY300HE通用電泳儀電源 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；EUROSTAR 40 Digital高速攪拌器 德國IKA公司；SU3500掃描電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本成分分析 水分含量測定：GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[14]；灰分含量測定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》[15]；總糖含量測定：苯酚-硫酸法[16]；蛋白質(zhì)含量測定 GB5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》[17]；總脂肪含量測定：GB5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[18]；膠原蛋白含量測定：羥脯氨酸含量檢測試劑盒。

1.2.2 海蜇膠原蛋白提取 參考張雯等[19]的方法對海蜇膠原蛋白進(jìn)行提取，稍作修改。取適量海蜇洗凈后，切成1 cm×1 cm的小塊，以料液比1:10 （w:v）添加正丁醇溶液，攪拌浸泡6 h進(jìn)行脫脂處理，處理結(jié)束后用去離子水清洗皮塊至無異味，收集沉淀。所得沉淀以1:15 （w:v）比例置于pH 2.0～2.5的HCl溶液中浸泡14 h，待膨脹均勻后，取出加適量去離子水打漿。皮漿中加入4.0 wt%胃蛋白酶，并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.3后酶解48 h，酶解結(jié)束后于10000 r/min離心20 min，取上清液緩慢加入1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7滅酶后，持續(xù)攪拌并加入粉末狀NaCl至溶液終濃度為1 mol/L，待NaCl完全溶解后靜置過夜，隨后將鹽析液于10000r/min離心60 min，收集沉淀復(fù)溶于0.1 mol/L冰乙酸溶液中，先將其置于0.05 mol/L冰乙酸溶液中透析24 h，再置于去離子水中透析48 h，凍干即得海蜇膠原蛋白樣品。以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.3 氨基酸組成分析 參照GB5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》[20]，取40 mg海蜇膠原蛋白樣品溶解于15 mL 6 mol/L HCl溶液中，加入苯酚3滴，抽真空封口后于110 ℃條件下水解22 h，采用氨基酸自動分析儀對其進(jìn)行分析。

1.2.4 SDS-PAGE分析 參考Laemmli等[21]的方法，稍作修改。取適量海蜇膠原蛋白樣品溶解于0.02 mol/L pH7.2的PBS緩沖液（含1% SDS、3.5 mol/L尿素）中，配制濃度為3 mg/mL的膠原蛋白溶液，按4:1比例與5×樣品緩沖液（非還原性電泳的樣品緩沖液中不含巰基乙醇）混合均勻，沸水浴5 min后取10 μL進(jìn)行測定。聚丙烯酰胺凝膠由5%的濃縮膠和8%的分離膠組成，先將電壓調(diào)至80 V，待樣品被壓縮為一條線后，調(diào)整電壓至120 V，待樣品至凝膠底部0.5 cm左右時停止。電泳結(jié)束后將膠條置于三氯乙酸溶液中固定15 min，考馬斯亮藍(lán)G-250中染色1 h，隨后反復(fù)脫色至膠條上的條帶清晰可見即可。

1.2.5 紫外全波長掃描（UV）分析 取適量海蜇膠原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L冰乙酸溶液中，配制濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液，在4 ℃下10000 r/min離心5 min后，取上清液進(jìn)行掃描分析。掃描波數(shù)為200～400 nm，速度為2 nm/s，同時以0.5 mol/L 冰乙酸溶液為空白對照。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 參考Zhu等[22]的方法，稍作修改。取適量海蜇膠原蛋白樣品與干燥的KBr混合均勻并壓成薄膜，置于樣品室內(nèi)進(jìn)行掃描分析。掃描波數(shù)為500～4000 cm-1，次數(shù)為64次，速度為0.2 cm/s，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 圓二色譜（CD）分析 參考Wang等[23]的方法，稍作修改。取適量海蜇膠原蛋白樣品溶解于50 mmol/L冰乙酸溶液中，配制濃度為0.3 mg/mL的膠原蛋白溶液，取少量上述溶液置于光程為1 mm的樣品池中進(jìn)行掃描分析。掃描波數(shù)為190～260 nm，溫度為4 ℃，同時以50 mmol/L冰乙酸溶液為空白對照。

1.2.8 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 取適量膠原蛋白樣品置于載物臺上，經(jīng)離子濺噴金處理后，用掃描電鏡在10.0 kV的加速電壓下放大50、100、250、500、1000倍觀察海蜇膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，每次實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

由表1可知，海蜇中大部分都是水分，僅含有不到10%的干物質(zhì)。在海蜇干物質(zhì)中，蛋白質(zhì)含量最大，可達(dá)73.03%，羥脯氨酸是膠原蛋白特有的一種氨基酸[24]，常被用于計算膠原蛋白的含量。因而根據(jù)海蜇中羥脯氨酸的含量，計算得出膠原蛋白的含量為1.96%，占蛋白質(zhì)總量39.12%。可見海蜇中膠原蛋白含量較為豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的水生膠原蛋白來源。

表1 海蜇基本成分分析Table 1 Analysis of basic ingredients of Rhopilema esculenta

2.2 氨基酸組成分析

由表2可知，海蜇膠原蛋白中含有7種必需氨基酸（Val、Ile、Leu、Phe、Met、Thr、Lys），占總氨基酸總量的20.19%。主要氨基酸為Gly，占氨基酸總量的25.99%。Gly對于膠原蛋白超螺旋結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要，它具有由單個氫原子構(gòu)成的極小側(cè)鏈，可存在于超螺旋的中心且不會發(fā)生鏈變形，從而使三個α螺旋緊密堆積在一起，形成具有疏水性的超螺旋結(jié)構(gòu)[25-26]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，由于亞氨酸（Pro+Hyp）的吡咯環(huán)會限制肽鏈二級結(jié)構(gòu)變化[27]，同時Hyp還通過羥基形成鏈間氫鍵[28]，維持膠原的三螺旋穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此膠原蛋白的亞氨酸含量對其穩(wěn)定性有很大的影響。海蜇膠原蛋白中亞氨酸含量為15.94%，略低于花鰻鱺魚（18.9%）[29]和鰻魚（20%）[30]，與鯉魚（15.4%）[31]膠原蛋白含量相似。此外，海蜇膠原蛋白中還含有豐富的Glu、Asp、Ala和Arg。其中，Glu和Asp是酸性氨基酸，二者對膠原蛋白的等電點影響較大[32]。His和Met含量較低，未檢測到半胱氨酸和色氨酸。

2.3 SDS-PAGE分析

海蜇膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。海蜇膠原蛋白中主要含有一條135 kDa左右的α-鏈，以及由α-鏈的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)所形成的一些二聚體β-鏈和三聚體γ-鏈。通過比較海蜇膠原蛋白在還原和非還原條件下的圖譜，發(fā)現(xiàn)二者條帶完全一致，說明海蜇膠原蛋白中不存在二硫鍵，即不存在含硫氨基酸，這是Ⅰ型膠原蛋白的一個特點[33]。另外，在48～100 kDa之間還觀察到少量條帶，這些小分子片段可能是由于胃蛋白酶對膠原蛋白的肽酶區(qū)域進(jìn)行部分切割而得到的降解片段[34]。由圖可初步判斷所提膠原蛋白為I型膠原蛋白，亞基結(jié)構(gòu)為[a1(I)]3，符合大多數(shù)水生膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征[35]。

表2 海蜇膠原蛋白的氨基酸組成分析Table 2 Amino acid composition of Rhopilema esculenta collagen

2.4 紫外全波長掃描分析

海蜇膠原蛋白在200～400 nm處的UV譜圖如圖2所示。其最大吸收峰位于233 nm處，這主要與肽鏈中含有的-C=O，-COOH和CO-NH2等生色基團(tuán)在230 nm附近具有明顯的吸收峰有關(guān)[30]。此外，在275 nm處還可觀察到一較弱的吸收峰，結(jié)合氨基酸分析，這可能是由于分子內(nèi)部仍含有少量的酪氨酸，存在共軛雙鍵引起的[36]。以上結(jié)果符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征，與Zhang[37]，蔡路昀[38]等報道的水生膠原蛋白的特性基本相似。

圖1 海蜇膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis pattern of Rhopilema esculenta collagen

圖2 海蜇膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectrum of Rhopilema esculenta collagen

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

海蜇膠原蛋白在500～4000 cm-1處的FTIR譜圖如圖3所示。在酰胺I、II、III以及A、B帶均可觀察到明顯的特征峰，說明海蜇膠原蛋白具有典型的膠原蛋白紅外光譜特征吸收峰。其中，酰胺A帶位于3272.06 cm-1處，該峰與膠原蛋白中N-H的伸縮振動以及羰基形成的氫鍵相關(guān)[30]。通常，N-H伸縮振動范圍為3400～3440 cm-1[30]，但當(dāng)其與肽鏈中含有的羰基形成的氫鍵結(jié)合時，其波數(shù)會藍(lán)移至3300 cm-1左右[39]。由此可說明海蜇膠原蛋白中存在氫鍵。此外，在2920.18 cm-1處還觀察到由CH2的不對稱伸縮振動引起的酰胺B帶[40]。

酰胺I、II和III帶的伸縮振動與膠原蛋白的氨基酸序列及三螺旋結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[41-42]。海蜇膠原蛋白的酰胺I帶位于1644.5 cm-1處，且吸收最強，該峰與肽鏈的C=O伸縮振動有關(guān)[43-44]，說明海蜇膠原蛋白處于交聯(lián)狀態(tài)。由N-H彎曲振動與C-N伸縮振動相耦合引起的酰胺II帶通常出現(xiàn)在1550～1600 cm-1之間[45-46]，當(dāng)肽鏈中有氫鍵存在時波數(shù)藍(lán)移[47]。海蜇膠原蛋白的酰胺II帶位于1548.08 cm-1處，進(jìn)一步證明了其肽鏈中存在氫鍵。特征頻率在1200～1320 cm-1之間，稱為酰胺III帶[48]，主要與酰胺鍵的C-N伸縮振動和N-H彎曲振動，以及Gly主鏈和Pro側(cè)鏈的CH2的搖擺振動有關(guān)[22]。有研究稱，當(dāng)酰胺III帶的峰值與1400～1454 cm-1范圍內(nèi)的峰值比例為1.0時，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)是完整的[49]。由圖知海蜇膠原蛋白酰胺III帶的波數(shù)為1238.08 cm-1，其與1454 cm-1譜帶之間的峰值比約為1.0，說明所提膠原蛋白具有較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 海蜇膠原蛋白的紅外吸收光譜圖Fig.3 FTIR spectrogram of Rhopilema collagen

圖4 海蜇膠原蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖Fig.4 Far-UV CD spectra of Rhopilema collagen

2.6 圓二色譜分析

圓二色譜是一種利用生物大分子對左旋和右旋圓偏振光的吸收差異來進(jìn)行立體結(jié)構(gòu)分析的方法[50]，根據(jù)電子躍遷能級能量的大小，蛋白質(zhì)的CD譜可分為遠(yuǎn)紫外（190～250 nm）、近紫外（250～340 nm）和紫外-可見（400～700 nm）三個區(qū)域，遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵所在的吸收范圍，對膠原蛋白在此范圍內(nèi)的譜帶位置和吸收強弱進(jìn)行分析，可較直觀的反映肽鏈的立體結(jié)構(gòu)信息[51]。因此，利用遠(yuǎn)紫外圓二色譜對海蜇膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，如圖4示，海蜇膠原蛋白在198 nm附近出現(xiàn)明顯的負(fù)吸收峰，在221 nm處有一較弱的正吸收峰，在213 nm處有一交叉點，這是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的典型CD特征，主要表現(xiàn)為β-折疊和無規(guī)則卷曲的疊加吸收。此外，圓二色譜的正負(fù)峰強度比稱為RPN，RPN值是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的特征性指標(biāo)[52]，非變性膠原的RPN值一般在0.12左右[53]，觀察到海蜇膠原蛋白的RPN值為0.11。以上光譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明了海蜇膠原蛋白保持了較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，與紅外吸收光譜分析結(jié)論一致。

圖5 海蜇膠原蛋白的外觀（A）和掃描電鏡圖（B～F）Fig.5 Rhopilema collagen (A) as viewed in naked eye, and (B～F) SEM micrograph

2.7 微觀結(jié)構(gòu)分析

膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)對其生物學(xué)功能有著關(guān)鍵性的影響。由圖5可知，凍干的海蜇膠原蛋白在肉眼下呈白色海綿狀固體，表面有均勻孔隙，觸之彈性較好。由SEM圖像，觀察到海蜇膠原蛋白具有多層聚集、以纖維為主的無規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在更高的放大倍數(shù)下，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)由相互纏繞的細(xì)絲和薄片構(gòu)成，且表面光滑細(xì)膩、疏松多孔，與Arumugam等[54]觀察到的龍利魚膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)相似，說明海蜇膠原蛋白保留了較完整的纖維結(jié)構(gòu)，排布比較疏松，可作為傷口敷料、止血劑或細(xì)胞增殖的基質(zhì)等廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程。

3 結(jié)論

采用鹽酸-胃蛋白酶法對海蜇膠原蛋白進(jìn)行制備并分析了其結(jié)構(gòu)特性。氨基酸組成分析表明海蜇膠原蛋白中甘氨酸含量最高，為25.99%，亞氨基酸含量為15.94%，未檢測到半胱氨酸和色氨基酸；紫外光譜和SDS-PAGE表明，所提取的海蜇膠原蛋白純度較高，亞基結(jié)構(gòu)為[a1(I)]3，符合I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征；傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜說明海蜇膠原蛋白具有較為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)；掃描電鏡結(jié)果顯示其保留了較完整的纖維結(jié)構(gòu)，且疏松多孔，可作為良好的藥物載體。海蜇膠原蛋白具備替代陸生哺乳動物膠原蛋白的潛力，在食品、化妝品、生物醫(yī)藥及組織工程等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。