梁蕊芳，張邦建，高麗霞，梁國良，李 瑛，王德寶，徐 龍

（內(nèi)蒙古包頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014035）

牛肉是世界上僅次于豬肉、家禽的第三大肉類消費(fèi)產(chǎn)品，其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸，可提高機(jī)體抵抗防御能力，中醫(yī)認(rèn)為牛肉具有補(bǔ)中益氣、滋養(yǎng)脾胃、強(qiáng)健筋骨等保健功效。牛肉產(chǎn)量較高，但深加工產(chǎn)品種類較少，結(jié)合高新技術(shù)加工而成的牛肉產(chǎn)品更少。隨著微生物益生菌研究與應(yīng)用逐漸深入，微生物發(fā)酵技術(shù)與肉制品融合的新產(chǎn)品逐漸被消費(fèi)者所認(rèn)同。肉制品加工過程中，接種發(fā)酵劑會使肉中蛋白質(zhì)與脂質(zhì)發(fā)生氧化降解生成小分子營養(yǎng)素和特征風(fēng)味物質(zhì)[1]；發(fā)酵劑在加工過程中快速繁殖促進(jìn)產(chǎn)品酸化，降低肉制品pH和水分活度（Aw），可抑制致病菌及腐敗菌生長繁殖，提高產(chǎn)品安全性和延長貨架期[2]。由于肉制品發(fā)酵期間溫度處于20～30 ℃，易促進(jìn)原料肉中從空氣或加工器具上混入的腸桿菌、腸球菌及其他有害雜菌的生長繁殖，Xie等[3]研究表明腸桿菌等雜菌與發(fā)酵香腸中生物胺的形成具有一定相關(guān)關(guān)系。近年來，由前體氨基酸經(jīng)微生物的氨基酸脫羧酶脫羧后形成具有芳香族（腐胺、尸胺、精胺、亞精胺）、脂肪族（β-苯乙胺、酪胺）及雜環(huán)結(jié)構(gòu)（色胺、組胺等）的生物胺[4-5]引起的食品安全問題成為了一大研究熱點(diǎn)。少量生物胺存在對機(jī)體具有重要生理功能，可以促進(jìn)生長、清除自由基及增強(qiáng)代謝和提高免疫力[6-7]；攝入過量生物胺則會引起血管擴(kuò)張、頭疼、呼吸紊亂、心悸、腹瀉等不良反應(yīng)，甚至?xí)斐蓹C(jī)體中毒[8]。李思寧等[9]在自然發(fā)酵及人工接種發(fā)酵劑的牦牛肉香腸中均檢測到酪胺、亞精胺等生物胺。孫欽秀等[10]研究表明，復(fù)合香辛料提取物可以有效抑制脂質(zhì)氧化、生物胺的積累。Baka等[11]通過接種清酒乳桿菌制作發(fā)酵香腸，表明其可顯著降低香腸中生物胺的含量。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)接種ZY-40植物乳桿菌可有效控制發(fā)酵鰱魚香腸中生物胺水平。王德寶等[13]研究不同復(fù)合發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸中生物胺形成的影響，結(jié)果表明植物乳桿菌與肉葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵劑相對單一發(fā)酵劑可降低香腸中生物胺整體含量水平。Van等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肉葡萄球菌和清酒乳桿菌復(fù)合發(fā)酵劑可降低發(fā)酵香腸中的腐胺與酪胺含量。近年來對于發(fā)酵牛肉干的研究，僅局限于牛肉干的工藝和基礎(chǔ)理化品質(zhì)變化方面[15-16]。目前，發(fā)酵牛肉干研究熱度逐漸擴(kuò)大，成為消費(fèi)者追求的一種發(fā)酵肉制品，而有關(guān)牛肉干中生物胺形成及含量變化對其食品安全性影響的報道甚少。

本文選擇清酒乳桿菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌為發(fā)酵劑，制作發(fā)酵牛肉干，探究復(fù)合發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干理化品質(zhì)及安全性能的影響，以期為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉：精選牛后腿肉 源自包頭市博克食品有限責(zé)任公司巴西進(jìn)口牛肉；腸衣 30～32 mm膠原蛋白腸衣；發(fā)酵劑：清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei，XR-1） 自行分離鑒定；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，BNCC 192624）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，BNCC 337469） 標(biāo)準(zhǔn)菌株，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；木瓜蛋白酶 10萬酶活力單位，美國Sigma-Aldrich公司；單磺酰氯 色譜級，衍生試劑，美國 Sigma-Aldrich公司；組胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺 色譜級，標(biāo)準(zhǔn)品，美國 Sigma-Aldrich公司；1,7-二氨基庚烷 色譜級，美國 Sigma-Aldrich公司；甲醇、正己烷、丙酮 色譜級，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；TG16-WS型臺式高速離心機(jī) 湖南離心機(jī)儀器有限公司；LRH-250-HS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 沈陽亮衡天平儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵牛肉干的制作

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)配方 牛肉100 g，食鹽2.5%，白糖0.56%，生抽2%，黃酒1.5%，味精0.2%，姜粉0.1%，黑胡椒0.15%，鮮洋蔥片5%，安息香酸鈉0.05%，木瓜蛋白酶0.04%，發(fā)酵劑（清酒乳桿菌:戊糖片球菌:木糖葡萄球菌為1:2:2）107CFU/g。

1.2.1.2 制作工藝 原料肉修整：選取牛后腿肉，剔除筋膜和脂肪，切成寬 × 厚 × 長為2 cm× 2 cm× 18 cm肉條。

嫩化：將切好的肉條與木瓜蛋白酶按照比例攪拌均勻后，置于50 ℃恒溫恒濕（90%）中嫩化2 h。腌制：嫩化結(jié)束后，將肉條與輔料、發(fā)酵劑等攪拌混勻置于4 ℃條件下腌制24 h。灌裝：將腌制好的肉條在紫外殺菌后無菌環(huán)境中灌入直徑為20～25 mm膠原蛋白腸衣中，排氣后兩端扎好。發(fā)酵：掛入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在30 ℃、90%～95%濕度條件下發(fā)酵2 d。成熟：成熟第一階段：牛肉干在溫度14～15 ℃、濕度為75%～85%條件下成熟3 d；成熟第二階段：在12～13 ℃、濕度為60%～75%條件下再成熟4 d。成熟結(jié)束后去除腸衣，將發(fā)酵好的牛肉干切成5 cm長度后進(jìn)行無菌包裝。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 通過添加清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖片球菌，將本試驗(yàn)分為發(fā)酵劑組（簡稱為LSS）及對照組（不添加外源發(fā)酵劑，簡稱為CO）。經(jīng)腌制、發(fā)酵、成熟加工而成發(fā)酵牛肉干，將腌制結(jié)束（0 d）、發(fā)酵結(jié)束（2 d）、成熟第一階段（5 d）、成熟第二階段（9 d）的四個階段牛肉干進(jìn)行取樣，然后保存于-80 ℃，測定肉干理化品質(zhì)及生物胺組成。

1.2.3 菌相的測定 菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、腸桿菌及葡萄球菌參照GB 4789.2-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》、GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》、GB 4789.41-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 腸桿菌科檢驗(yàn)》等方法進(jìn)行測定[17-19]，肉干中木糖葡萄球菌利用MSA 培養(yǎng)基 30 ℃ 48 h后進(jìn)行計數(shù)。

1.2.4 理化指標(biāo)的測定 參照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》[20]、使用HD-3A型智能水分活度儀、CR-410型色差計測定香腸pH、Aw、紅度值（a*）。

1.2.5 生物胺含量的測定 參照 GB 5009.208-2016測定發(fā)酵牛肉干中生物胺含量[21]。

色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速 0.8 mL/min，紫外檢測波長 254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，流動相 A為90%乙腈+10%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，B 為90%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液 + 10%乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.6 感官評價 通過對牛肉干進(jìn)行感官評價，確定發(fā)酵劑接種對最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響。外觀、顏色、味道、質(zhì)地和整體質(zhì)量屬性用9分制（1分=非常差，9分=非常好）進(jìn)行評估。感官小組由9名訓(xùn)練有素、來自于包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品專業(yè)的小組成員組成。實(shí)驗(yàn)是在通風(fēng)良好的房間里在20～22 ℃下進(jìn)行。將樣品切成4 mm厚，裝入直徑5 mm有蓋的塑料容器中，樣品隨機(jī)編號。為小組成員提供了水和面包，以清洗和清潔評價成員口腔。感官數(shù)據(jù)使用非參數(shù)Mann Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 19.0對生物胺數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和顯著性處理，利用Sigmaplot 12.5制作柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干菌相組成的影響

發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干中菌相組成的影響如表2。腌制結(jié)束，牛肉干中總菌數(shù)量處于8.22～8.53 CFU/g；隨著牛肉干進(jìn)入發(fā)酵成熟過程，總菌數(shù)數(shù)量快速增加，發(fā)酵結(jié)束時CO與LSS兩組總菌數(shù)數(shù)量分別達(dá)到8.99、9.38 CFU/g；5 d末LSS組增加到9.85 CFU/g，高于CO組的9.36 CFU/g；進(jìn)入5～9 d的成熟第二階段，CO、LSS組分別下降了0.29、0.72個單位。總菌數(shù)的快速增長期為0～5 d的發(fā)酵和成熟初期，2～5 d總菌數(shù)增長幅度小于0～2 d的發(fā)酵期。其中牛肉干中乳酸菌數(shù)量與總菌數(shù)變化相一致，腌制結(jié)束時LSS組乳酸菌數(shù)量（8.18 CFU/g）高于CO組（6.36 CFU/g），這可能是發(fā)酵劑組添加乳酸菌發(fā)酵劑對這一差異起到主要作用。在成熟第一階段結(jié)束（5 d）時，乳酸菌數(shù)量達(dá)到最高，顯著高于其他階段（P＜0.05）。且乳酸菌數(shù)量高于葡萄球菌數(shù)量較高，說明接種的乳酸菌對肉環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，乳酸菌也有助于改善發(fā)酵香腸的理化品質(zhì)，如質(zhì)地、風(fēng)味、感官等特性[22]。牛肉干中葡萄球菌數(shù)量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，在5 d末時數(shù)量達(dá)到最高。造成這一結(jié)果的原因可能是由于進(jìn)入成熟過程中環(huán)境溫度、濕度急劇下降及香腸內(nèi)部水分的散失，致使5～9 d成熟過程中乳酸菌和葡萄球菌數(shù)量逐漸降低[2,22]。在整個加工過程中，CO組大腸桿菌數(shù)量變化微小，LSS組腸桿菌數(shù)量由0 d的5.84CFU/g下降到2.04 CFU/g，說明肉干中腸桿菌受到了接種的發(fā)酵劑的強(qiáng)烈抑制作用。降低香腸中腸桿菌數(shù)量可以減少更多有害物質(zhì)如生物胺[3]的生成。

表2 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干發(fā)酵成熟過程菌相變化的影響Table 2 Effect of starter cultures on microbial phase composition of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.2 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干pH的影響

發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干pH變化的影響如圖1。由圖1可知，牛肉起始pH較高，近為6.20。在0～2 d，隨著發(fā)酵期間乳酸菌和葡萄球菌等菌種數(shù)量的大幅增加，促使CO和LSS組pH大幅下降，Lorenzo、Wang、Nie等[23-25]研究結(jié)果表明發(fā)酵期間乳酸菌等發(fā)酵劑數(shù)量快速增加促使肉中碳水化合物分解為乳酸等小分子有機(jī)酸，且發(fā)酵劑組因清酒乳桿菌等發(fā)酵劑的添加，促進(jìn)LSS組pH（4.43）顯著低于CO組（5.03）（P＜0.05）。在2～5 d成熟初期，因菌種仍有小幅上升，引起發(fā)酵牛肉干pH保持持續(xù)下降的趨勢。5～9 d成熟過程，菌株活性受到低溫、低pH、低濕度的強(qiáng)烈抑制，菌種數(shù)量大幅下降，此時酸度下降的速率可能小于蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨、三甲胺等堿性物質(zhì)速率[26]，致使牛肉干pH在此階段呈現(xiàn)小幅回升的現(xiàn)象。低pH有利于改善香腸色澤、口感、改變蛋白質(zhì)與水分結(jié)合能力和抑制肉干中腸桿菌等一類有害及致病菌生長繁殖。成熟結(jié)束后牛肉干pH低于發(fā)酵肉制品安全酸度要求5.3[27]。

圖1 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干發(fā)酵成熟過程pH變化的影響Fig.1 Effect of starter cultures on pH value of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.3 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干Aw值的影響

水分活度值（Aw）高低是衡量香腸保質(zhì)期的一個重要柵欄技術(shù)因子。Aw低于0.9時，食品中腐敗菌生長受到抑制；低于0.85時，酶活性大幅下降；低于0.6時，霉菌及耐鹽菌活性降到最低[28-29]。

腌制結(jié)束，兩組水分活度值（Aw）均為0.91；發(fā)酵過程中，CO組Aw值沒有變化，LSS組僅下降0.1個單位。2～5 d成熟第一階段，發(fā)酵牛肉干Aw值下降幅度增大，5 d末CO、LSS兩組分別降為0.81、0.84。而在5～9 d成熟第二階段，CO、LSS兩組Aw值下降幅度分別為13.67%、15.53%，LSS組下降幅度高于CO，但差異不顯著（P＞0.05）。成熟結(jié)束，兩組Aw值差異不明顯，說明發(fā)酵劑對牛肉干Aw值變化影響較小。牛肉干水分活度及pH均顯著下降，低Aw值、pH有利于抑制肉干中可產(chǎn)生致癌物亞硝胺的腸桿菌等有害菌及致病菌生長繁殖，從而可提高產(chǎn)品品質(zhì)和安全性，延長產(chǎn)品貨架期[30]。

圖2 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干發(fā)酵成熟過程水分活度變化的影響Fig.2 Effect of starter cultures on water activity of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.4 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干紅度值的影響

發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉色澤的影響如圖3。發(fā)酵牛肉干的紅度值呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。在0～2 d發(fā)酵過程中，兩組紅度值均上升，發(fā)酵結(jié)束后CO與LSS組紅度值（a*）分別為20.41、22.34。此時紅度值的增加可能與發(fā)酵劑快速產(chǎn)酸、促使亞硝酸鹽在酸性條件下與肌紅蛋白結(jié)合形成呈現(xiàn)玫瑰紅的亞硝肌紅蛋白有關(guān)[31-33]。成熟過程中，牛肉干紅度值大幅下降，與肉干在成熟過程中水分大量蒸發(fā)、肉色進(jìn)而變?yōu)榘导t色有關(guān)，也可能與微球菌數(shù)量降低，致使產(chǎn)生可破壞由乳酸菌類形成的過氧化氫（H2O2）的過氧化氫酶數(shù)量和活性的下降，未能阻斷H2O2對血紅素色素的氧化所致[11]。成熟結(jié)束，CO、LSS兩組紅度值相差1.90個單位，差異較小。說明，發(fā)酵劑對肉干的色澤在發(fā)酵和成熟第一階段影響較大。

圖3 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干發(fā)酵成熟過程紅度變化的影響Fig.3 Effect of starter cultures on red color of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.5 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干生物胺組成的影響

發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干中生物胺的影響如圖4，共檢出苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、組胺及酪胺六種生物胺。其中苯乙胺是一種芳香胺，會被單胺酶氧化分解，可有效防止其在人體腦部集中。由圖4A可知，發(fā)酵肉干中苯乙胺含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，CO組在5 d末含量顯著高于其他階段（P＜0.05），LSS組整個過程中含量變化微小，且均未超過1 mg/kg。色胺是色氨酸經(jīng)氨基酸脫羧酶脫羧后形成，其具有血管收縮的作用，整個過程含量變化均未超過2 mg/kg；對于色胺的變化，2～9 d LSS組含量均高于CO組，說明添加清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌有利于色胺的小幅積累。尸胺和腐胺被用作衡量紅肉和食品衛(wèi)生的重要指標(biāo)[34]，最終含量均低于美國食藥局毒性最高限量指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)（100 mg/kg）[35]。由圖4C～D可知，腌制結(jié)束0 d肉中腐胺、尸胺含量較低，說明原料肉比較新鮮；隨著進(jìn)入發(fā)酵和成熟過程，CO組中腐胺和尸胺含量急劇增加，各階段含量差異顯著（P＜0.05），特別是腐胺含量在成熟結(jié)束時增長到95.92 mg/kg，顯著高于同期的LSS組腐胺含量19.05 mg/kg（P＜0.05）；LSS組中尸胺和腐胺含量變化為先上升后下降，在發(fā)酵結(jié)束時含量達(dá)到最高，均低于40.00 mg/kg。據(jù)Baka等[11]報道稱，尸胺和腐胺的形成與腸桿菌科和假單胞菌的脫羧酶活性有關(guān)，Suzzi等[36]研究報道稱腸桿菌科是腐胺和尸胺的形成和積累的主要微生物，具有較高脫羧酶活性。綜合表明，接種的清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵劑可強(qiáng)烈抑制腸桿菌等產(chǎn)胺菌活性，進(jìn)而可大幅控制肉干中尸胺和腐胺含量變化，對提高肉干衛(wèi)生質(zhì)量具有重要的貢獻(xiàn)作用。從毒性角度看，組胺是毒性最高的生物胺，尸胺、腐胺、酪胺等胺類的存在對其毒性具有輔助作用，可增強(qiáng)其毒性[24,37]。0～9 d，兩組肉干中酪胺含量變化微小，且成熟結(jié)束時LSS組含量低于CO組。而肉干中組胺含量大幅上升，發(fā)酵結(jié)束時CO、LSS組分別為60.62、50.50 mg/kg；后期成熟過程中，兩組組胺含量大幅下降，說明產(chǎn)組胺菌受溫度變化影響較大，成熟結(jié)束LSS組含量（22.56 mg/kg）低于CO組（47.00 mg/kg）。說明添加上述復(fù)合發(fā)酵劑對產(chǎn)組胺菌產(chǎn)生較強(qiáng)抑制作用，結(jié)合溫度的變化，接種上述發(fā)酵劑制作發(fā)酵肉干可顯著提高其安全性能。

圖4 發(fā)酵劑對發(fā)酵牛肉干中生物胺組成的影響Fig.4 Effects of starter cultures on biogenic amine composition in fermented beef jerky

2.6 發(fā)酵牛肉干感官評定

通過對成熟后發(fā)酵牛肉干感官評價，衡量消費(fèi)者對發(fā)酵牛肉干的可接受度，評價結(jié)果如表3所示?？赡苡捎谔砑影l(fā)酵劑促使肉干pH的快速下降，改變了肌肉蛋白與水分的結(jié)合能力，促進(jìn)肉干內(nèi)部水分不斷向外部擴(kuò)散，使得發(fā)酵組肉干內(nèi)外干燥程度一致，使發(fā)酵劑組外觀優(yōu)于對照組。隨著pH的下降，肉干中硝酸鹽與肌紅蛋白逐漸結(jié)合形成呈現(xiàn)鮮紅色的亞硝肌紅蛋白，使得LSS組紅度色澤明顯高于CO組。發(fā)酵成熟過程中，牛肉干肌肉和脂質(zhì)可能被添加的微生物發(fā)酵劑分解為小分子物質(zhì)—游離氨基酸和脂肪酸，這部分氨基酸和脂肪酸在發(fā)酵劑和酶的作用下，可生成特殊風(fēng)味物質(zhì)，使得肉干在成熟過程中風(fēng)味物質(zhì)不斷積累。這可能是造成發(fā)酵劑組與對照組風(fēng)味差異的原因。隨著肌肉蛋白質(zhì)的分解，大分子蛋白被分解成多肽，從而改善了肉干的質(zhì)構(gòu)。綜合以上指標(biāo)的變化，使得發(fā)酵劑組牛肉干的整體可接受度高于對照組。

表3 感官評價Table 3 Sensory evaluation

3 結(jié)論

接種清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵劑促使肉干中乳酸菌成為優(yōu)勢菌，5 d時LSS組乳酸菌與葡萄球菌數(shù)量迅速增加至9.78、8.83 CFU/g，高于CO組；加快產(chǎn)品酸化速率，降低肉干的水分活度，顯著抑制了腸桿菌數(shù)量，致使成熟結(jié)束后LSS組腸桿菌數(shù)量（2.04 CFU/g）僅占CO組的2/5；接種復(fù)合發(fā)酵劑降低了肉干中尸胺、腐胺、組胺含量，成熟結(jié)束LSS生物胺總量為66.02 mg/kg，遠(yuǎn)低于CO組的212.14 mg/kg。因而，添加上述復(fù)合發(fā)酵劑有利于縮短肉干加工周期，改善產(chǎn)品紅度色澤，提高產(chǎn)品品質(zhì)和安全性能。