侯楚璇，蘇德智，馮秀靜，張昆華 ，陸海勤，李 凱,5

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西寧明東亞糖業(yè)有限公司，廣西寧明 532501；3.崇左幼兒師范高等?？茖W(xué)校，廣西崇左 532200；4.許昌市建安區(qū)第一高級(jí)中學(xué)，河南許昌 461111；5.廣西大學(xué)，糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西南寧 530004）

甘蔗汁中含有多種維生素、果糖、氨基酸、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有清熱解毒，止渴生津，滋陰潤(rùn)燥等功效。甘蔗汁擁有較高的甜度及特有的風(fēng)味，無論是甘蔗汁飲料或與其他果汁搭配，均能得到較好的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但隨著我國(guó)消費(fèi)者消費(fèi)能力的提升，飲料體系穩(wěn)定、果汁無渾濁已成為新的市場(chǎng)需求。因此，額外加工對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行加工或丟棄由絮凝物引起渾濁的產(chǎn)品對(duì)生產(chǎn)商造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。

由于原料及加工工藝的不同，絮凝物的形成原因也各不相同，分子間的相互作用[4]、原料所包含的特殊成分[5-9]、微生物的作用[1]以及飲料的貯存條件[2,10]等均會(huì)影響絮凝物的生成。除此之外，由于所添加甜味劑的質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，也是飲料產(chǎn)生絮凝物的原因之一[11-13]。目前有研究利用化學(xué)溶解或物理消除等方法去除絮凝物，如利用超聲技術(shù)處理白糖水溶液[14]和利用陶瓷膜技術(shù)對(duì)甘蔗汁進(jìn)行超濾[15-16]，但均未從根源上解決問題，抑制絮凝物的生成[9,17]。已有針對(duì)飲料中酸性絮凝物的生成條件及原因的研究，但通過陶瓷膜過濾的甘蔗汁一般呈弱堿性，而這種堿性條件下甘蔗汁中絮凝物的生成條件及原因卻鮮有報(bào)道[18-21]。

本實(shí)驗(yàn)將通過控制pH確定其對(duì)甘蔗汁中堿性絮凝物的影響，并對(duì)堿性絮凝物的組成成分進(jìn)行研究，為甘蔗汁飲料的工業(yè)化生產(chǎn)過程中抑制絮凝物的生成提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗清汁 由廣西某糖廠提供，經(jīng)膜孔徑為50 nm的陶瓷膜過濾后，于-18 ℃冰箱冷凍保存；氫氧化鈉、磷酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、乙酸鎂、溴化鉀分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、硫酸、濃鹽酸 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、堿性酒石酸銅 分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑三廠。

TENSOR傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)BRUKER公司；S-3400N帶能譜儀的電子掃描顯微鏡 日本日立公司；其他 均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備與儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對(duì)甘蔗汁產(chǎn)生絮凝物的影響 將150 mL甘蔗汁加入到250 mL的錐形瓶中, 連接回流冷凝管與錐形瓶，然后將其置于水浴鍋中，分別在20、40、60、80、100 ℃下水浴40 min，并與放置在室溫下的甘蔗汁空白樣進(jìn)行對(duì)照，觀察水浴過程中是否生成絮凝物。水浴結(jié)束后，使其冷卻至室溫，并觀察絮狀物是否發(fā)生變化。

1.2.2 pH對(duì)甘蔗汁產(chǎn)生絮凝物的影響 分別添加20 mL甘蔗汁至具塞玻璃試管中，使用85%的磷酸和0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，將甘蔗汁的pH精準(zhǔn)調(diào)節(jié)至：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。將調(diào)節(jié)過pH的甘蔗汁在室溫下靜置1 h，這是由于甘蔗汁中含有大量的糖類物質(zhì)，久置于室溫下易腐壞，為防止樣品腐壞影響到檢測(cè)結(jié)果，將樣品的靜置時(shí)間合理縮短。靜置后，將試管置于光線明亮處觀察不同pH的甘蔗汁中絮凝沉淀物的生成情況。

1.2.3 絮凝物的制備 分別添加200 g經(jīng)陶瓷膜過濾后的甘蔗汁至500 mL燒杯中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將甘蔗汁的pH精準(zhǔn)調(diào)節(jié)至：7、8、9、10、11，獲得含有絮凝物的甘蔗汁，等待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。取離心管進(jìn)行編號(hào)，并稱量以記錄每個(gè)管的質(zhì)量。除去靜置后得到的甘蔗汁上清液，并將下層沉淀物質(zhì)轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以4500 r/min的速度離心20 min，并再次除去上清液。向離心管中加入適量的70%乙醇溶液，并通過振蕩洗滌沉淀物。重復(fù)上述步驟5次左右，直到清洗液呈無色透明狀。洗滌后，帶離心管稱重，記錄在不同pH下產(chǎn)生的絮凝沉淀物的質(zhì)量，并用作提取得到的絮凝物以備后用。

1.3 絮凝物的成分分析

1.3.1 絮凝物中粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 絮凝物中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法將參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[22]，凱氏定氮法測(cè)定氮。

1.3.2 絮凝物中總糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱量0.5 g制備所得樣品，并轉(zhuǎn)移至250 mL錐形燒瓶中。分別量取50 mL蒸餾水和25 mL濃鹽酸，依次加入到樣品中。將錐形瓶固定在水浴鍋中，設(shè)定溫度100 ℃，水浴2 h，取出靜置冷卻至室溫，向錐形瓶中添加適量1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)樣品溶液pH至中性，再將樣品溶液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，并定容。

在250 mL的錐形瓶中，依次加入5 mL的堿性酒石酸銅試液（甲液/乙液），加入10 mL的蒸餾水，加熱煮沸，然后使用樣品的水解液進(jìn)行滴定，記錄消耗的滴定劑的量[16]。

計(jì)算公式如下：

1375 胰腺癌石蠟包埋組織中微 RNA 原位雜交檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化 倪晨明，倪燦榮，金 鋼，焦莉娟，李連峰，鄭建明

式中，X：樣品中多糖的含量（以葡萄糖計(jì)），%；f：10 mL斐林試劑甲乙混合液相當(dāng)?shù)钠咸烟琴|(zhì)量，mg；m：樣品質(zhì)量，g；V：所消耗樣品總體積，mL。

1.3.3 絮凝物中灰分含量的測(cè)定 絮凝物中灰分含量的測(cè)定方法將參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》[23]第一法。

1.3.4 傅里葉紅外光譜分析絮凝物中官能團(tuán) 將制備得到的絮凝物樣品置于烘箱中，并在60 ℃條件下干燥約10 h。將1～2 mg干燥的待測(cè)樣品與50～60 mg干燥的溴化鉀粉末混合，置于瑪瑙研缽中將其磨成均勻的細(xì)粉末，并放入壓模中在10 kPa壓制成透明薄片。將薄片取出放入紅外光譜儀，在4000～500 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.3.5 掃描電子顯微鏡及能譜儀元素分析 取少量干燥過的待測(cè)絮凝物樣品，研磨成粉末狀，用掃描電鏡（SEM）分析其絮凝結(jié)構(gòu)，用能譜（EDs）分析絮凝物中主要元素種類，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)為平行實(shí)驗(yàn)平均值。采用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Origin 2019軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和pH對(duì)甘蔗汁中生成絮凝物的影響

圖1為溫度對(duì)甘蔗汁中絮凝物產(chǎn)量的影響，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)甘蔗汁中絮凝物的生成量沒有明顯的變化，因此溫度對(duì)絮凝物的生成沒有明顯影響，在本研究中不再進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 溫度對(duì)甘蔗汁中絮凝物產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of temperature on flocculation yield in sugarcane juice

從圖2可以看出，甘蔗汁中的絮凝含量隨pH的增加而增加。研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件（pH小于7）下沒有產(chǎn)生絮凝，主要由于甘蔗汁中糖類物質(zhì)主要由甘露醇和半乳糖單體組成，酸性條件下，二者相互作用生成半乳甘露聚糖大分子物質(zhì)，該物質(zhì)可被陶瓷膜完全濾除[15]。在堿性條件下，隨著pH的增加，甘蔗汁中絮狀物產(chǎn)量增加，表明堿性條件或氫氧根能促進(jìn)甘蔗汁中絮狀物的產(chǎn)生。

圖2 pH對(duì)甘蔗汁中絮凝物產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of pH on flocculation yield in sugarcane juice

2.2 絮凝物中蛋白質(zhì)含量的變化

中國(guó)大多數(shù)制糖廠使用亞硫酸澄清工藝生產(chǎn)白糖，酸性絮凝物主要由含氮物質(zhì),如蛋白質(zhì)組成，其含量約為19.4%～30.7%[24]。從圖3可以看出，經(jīng)陶瓷膜超濾后的甘蔗汁中絮凝物蛋白質(zhì)含量隨pH的增加有少量的增加，但蛋白質(zhì)在總成分中均占比很小，僅占3.00%左右。這是由于孔徑尺寸為50 nm的陶瓷膜可以有效過濾去除大部分的大分子量的蛋白質(zhì)。因此，經(jīng)過超濾的甘蔗汁所生成的絮狀物中蛋白質(zhì)含量較低。

圖3 不同pH下絮凝物中蛋白質(zhì)含量變化Fig.3 The content of protein in flocculates varied at different pH values

2.3 絮凝物中總糖含量的變化

從圖4可以看出，在不同pH下絮凝物中主要組成成分中，總糖含量為60.98%～69.45%，隨pH的升高，總糖含量呈下降趨勢(shì)，其含量占比遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)含量，這是因?yàn)楦收嶂械亩嗵俏镔|(zhì)包含鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖等可形成多糖的單糖。這些多糖分子與其他物質(zhì)（例如氫氧根、金屬離子或蛋白質(zhì)）相互作用形成凝膠，而金屬離子，尤其是鈣離子，促進(jìn)了凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致其形成了囊狀結(jié)構(gòu)，該種結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的吸引力增強(qiáng)，從而引起了絮凝物的形成[25]。從圖4可以看出，糖類物質(zhì)在絮凝物中所占比重最大，可以判斷出絮凝物主要由糖類物質(zhì)組成，因此糖類是甘蔗汁中絮凝物的主要組成成分之一。

圖4 不同pH下絮凝物中總糖含量變化Fig.4 The content of total sugar in flocculates varied at different pH values

2.4 絮凝物中灰分含量的變化

從圖5可以看出，在堿性條件下，隨pH的增加，絮凝物中的灰分含量先增加后減少，當(dāng)pH為9時(shí)，絮凝物中的灰分含量最高，約占25.58%，可以看出灰分是影響絮凝物生成的重要因素之一。雖然甘蔗植物中金屬離子的含量較低，主要包含鈣、鐵及少量其他金屬元素，然而在甘蔗汁壓榨和運(yùn)輸?shù)倪^程中，由于設(shè)備的磨損及其他原因，外部金屬離子易混入甘蔗汁中，從而增加了甘蔗汁的灰分含量[26]。

圖5 不同pH下絮凝物中灰分含量變化Fig.5 The content of ash in flocculates varied at different pH values

圖6 不同pH條件下絮凝物的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of flocs with different pH environments

2.5 絮凝物紅外光譜分析

通過上述研究可以發(fā)現(xiàn)，pH較小的升高對(duì)不同成分的占比影響較小，因此取pH為7、9、11三個(gè)位置的絮凝物進(jìn)行紅外光譜分析。通過對(duì)以上紅外光譜圖進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)，不同pH下絮凝物的官能團(tuán)組成類型相對(duì)一致，但絮凝物中存在代表蛋白質(zhì)N-H鍵的伸縮振動(dòng)峰以及分子間氫鍵O-H的伸縮振動(dòng)峰，在不同pH條件下出現(xiàn)的位置有所差異[27]。當(dāng)pH為7、9和11時(shí)，這兩個(gè)峰分別出現(xiàn)在3418、3421、3423 cm-1三個(gè)位置。另外，三張圖中均出現(xiàn)了向內(nèi)彎曲的N-H鍵特征峰，其位置分別出現(xiàn)在1621、1625 cm-1以及1627 cm-1。樣品中也均包括了烷烴向內(nèi)彎曲的C-H鍵吸收峰以及代表醇類的向內(nèi)彎曲的-OH鍵吸收峰。區(qū)別在于，C-H鍵吸收峰在pH為7、9和11時(shí)分別出現(xiàn)在1421、1459 cm-1和1420 cm-1三個(gè)位置，而-OH鍵吸收峰在pH為7和11時(shí)均出現(xiàn)在1353 cm-1處，pH為9時(shí)出現(xiàn)在1350 cm-1處。當(dāng)pH為7、9和11時(shí)，均在785 cm-1左右，發(fā)現(xiàn)代表含醛基類物質(zhì)的向外彎的C-H鍵吸收峰以及代表胺類的向外彎曲的N-H鍵的吸收峰，在1045～1060 cm-1處均存在代表蛋白質(zhì)C-N鍵的吸收峰。通過以上可以判斷出，甘蔗汁中的絮凝物中含有具有N-H鍵的蛋白質(zhì)，以及具有羥基、醛基等官能團(tuán)的多糖，即絮凝物主要由蛋白質(zhì)、多糖為主的多種有機(jī)物質(zhì)組成。

圖7 pH9時(shí)絮凝物掃描電鏡圖Fig.7 SEM of flocculent at pH9

圖8 pH11時(shí)絮凝物掃描電鏡圖Fig.8 SEM of flocculent at pH11

2.6 掃描電子顯微鏡及能譜儀元素分析

通過比較在pH為9和pH為11情況下絮凝物的100 μm的SEM圖像，可以看出在pH為9時(shí)絮凝物的沉淀顆粒比在pH為11時(shí)絮凝物的沉淀顆粒小。這是由于隨著pH的升高，使甘蔗汁內(nèi)生成更多鹽類沉淀物質(zhì)。在后續(xù)的能譜分析中也可以發(fā)現(xiàn)，沉淀物質(zhì)主要由鈣鹽組成，可能是碳酸鈣和磷酸鈣。這類鈣鹽在堿性條件下更易產(chǎn)生，且會(huì)與蛋白質(zhì)等膠質(zhì)物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在一起，形成了較大的絮狀結(jié)構(gòu)。

圖9 pH為9的絮凝物掃描電鏡的能譜取樣點(diǎn)Fig.9 EDS sampling point of floes at pH 9

由圖9可以看出，能譜的采樣點(diǎn)在晶體材料上。從圖10可以看出，絮凝樣品中所含的元素是C、O、Si、P、K、Ca、Mn和Fe。其中，Ca元素相對(duì)含量最大，而鈣元素僅有少部分來自于甘蔗本身，大部分鈣元素主要在生產(chǎn)過程中通過添加石灰乳以調(diào)節(jié)甘蔗汁的酸堿值而添加到甘蔗汁中。其次是磷元素，其主要來源是在澄清工段中所添加的磷酸，在此階段，鈣離子將與磷酸鹽反應(yīng)生成磷酸鈣沉淀。鉀元素的主要來源有兩個(gè)，分別是甘蔗和水，而鐵元素主要來源于榨汁工段，由于榨機(jī)磨損而混入榨汁中。甘蔗汁中鐵離子可與氫氧根反應(yīng)生成沉淀物，也會(huì)與其他無機(jī)物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng) ，形成絮狀沉淀。甘蔗中含有一定量的硅元素，硅在甘蔗汁體系中可與其他金屬離子發(fā)生反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的沉淀物，這也是造成甘蔗汁產(chǎn)生絮凝的一個(gè)重要原因。除此之外，在堿性條件下，錳離子和鎂離子與甘蔗汁中游離的氫氧根反應(yīng)，形成氫氧化錳、氫氧化鎂兩種沉淀物質(zhì)。堿性條件還可以促進(jìn)金屬離子（如鐵離子和鈣離子）與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，生成絮凝物膠體結(jié)構(gòu)。氫氧化鐵膠體結(jié)構(gòu)可以通過吸附帶負(fù)電荷的游離氫氧根離子，進(jìn)而在甘蔗汁中吸附帶正電的離子及大分子，生成絮凝物。另外磷酸鈣物質(zhì)可通過聚集其他沉淀物質(zhì)，構(gòu)成絮凝物。

圖10 pH為9的絮凝物的能譜圖Fig.10 EDS of floes at pH 9

由圖11、圖12可知，當(dāng)pH為11時(shí)，元素類型與pH9時(shí)的元素類型相同，并且均為鈣和磷的含量最高。因此，可以推斷出絮凝的無機(jī)物成分主要由磷酸鈣組成。另外還含有鉀、錳、鈣、鐵、碳、氧等元素。pH為11時(shí)絮凝中各種元素的含量較高，表明甘蔗汁的堿度越強(qiáng)，氫氧化鐵膠體能夠凝結(jié)的金屬離子和有機(jī)物越多，產(chǎn)生的絮凝沉淀越多。

圖11 pH11的絮凝物掃描電鏡的能譜取樣點(diǎn)Fig.11 EDS sampling point of floes at pH11

3 結(jié)論

甘蔗汁的pH對(duì)絮凝物的形成具有明顯影響。在酸性條件下，甘蔗汁中沒有明顯的絮凝，因此甘蔗汁在生產(chǎn)酸性飲料時(shí)，具有較大優(yōu)勢(shì)；調(diào)整甘蔗汁的酸堿度至堿性，果汁中會(huì)迅速產(chǎn)生絮凝，且隨著堿性的增加，絮凝物增多，因此，通過調(diào)節(jié)經(jīng)膜過濾的甘蔗汁的pH可以抑制絮凝的產(chǎn)生。若需要用甘蔗汁生產(chǎn)弱堿性飲料，則需注意飲料中絮凝物的去除。

圖12 pH11的絮凝物的能譜圖Fig.12 EDS of floes at pH11

通過檢測(cè)絮凝物的主要成分，可以發(fā)現(xiàn)在pH為7～11的條件下，該種絮凝物中蛋白質(zhì)含量約為1.93%～3.68%，糖類物質(zhì)含量約為60.98%～69.45%，灰分物質(zhì)含量約為23.64%～25.58%。通過電子掃描-能譜分析，甘蔗汁中的絮凝主要由鈣、磷、鐵、硅、錳、碳、氧和其他元素組成。磷酸鈣是絮凝的主要成分。通過分析紅外光譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同pH條件下，絮凝物中的官能團(tuán)（主要是蛋白質(zhì)和糖類）保持不變，這表明在堿性條件下，糖和蛋白質(zhì)之間的相互作用可能產(chǎn)生絮凝。此時(shí)甘蔗汁是堿性的，可與鐵、鈣離子生成氫氧化鐵、氫氧化鈣沉淀，這些沉淀會(huì)與多糖，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)起來，生成肉眼可見的絮狀沉淀物。