陳建苗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病原生物學(xué)系, 北京 100005)

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)是一種對細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期、胚胎形成、血管生成和新陳代謝等細(xì)胞活動的進(jìn)行具有重要意義的蛋白酶[1-2]。因此,RTKs表達(dá)異常會引起多種疾病和腫瘤[3-4]。RTKs胞外區(qū)與配體結(jié)合，激活RTKs胞內(nèi)區(qū)的激酶活性，使含有Src同源區(qū)2(Src homology 2，SH2)和磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)(phosphotyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域的蛋白與胞內(nèi)區(qū)段結(jié)合被激活蛋白酶活性[1]。NOK(the novel oncog-ene with kinase-domain,NOK)是一種新型受體酪氨酸激酶。研究發(fā)現(xiàn) NOK具有致癌作用[5]。對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后具有重要意義[6-8]。Asp-Phe-Gly(DFG)基序位于激酶活性中心活化環(huán)的起始部位，由天冬氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和甘氨酸殘基3個氨基酸殘基組成，對調(diào)節(jié)激酶活性具有重要意義[9-11]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，NOK激酶中沒有此結(jié)構(gòu)。于是，本研究擬通過同源配對定點加入DFG基序，以探究DFG-NOK對NIH3T3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期G1/S的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；新生牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；Neofect 轉(zhuǎn)染試劑(北京碼因科技有限公司)；MTT試劑(Sigma公司)；CCK8試劑(MedChenExpress公司)；Western blot相關(guān)試劑和PI染料(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；PCR引物、pcDNA3.0-DFG-NOK的構(gòu)建及測序(上海生工公司)；感受態(tài)大腸桿菌(天根生化科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶和定點突變試劑盒(TaKaRa公司)；抗β-actin和NOK抗體(Proteintech公司)；抗Akt、p-Akt、 Erk、p-Erk和cyclin D1抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；抗STAT1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗p-STAT1抗體(Bioworld公司)；抗STAT3和p-STAT3抗體(Cell Signaling公司)；抗JAK3和p-JAK3抗體(Anbo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將NIH3T3細(xì)胞置于含有10%新生牛血清DMEM的50 mm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次。貼壁細(xì)胞達(dá)到90%匯合后，接種到30 mm培養(yǎng)皿中，24 h后換液。用Neofect高效轉(zhuǎn)染試劑順時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)入pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK和pcDNA3.0-DFG-NOK,轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h后收細(xì)胞。

1.2.2 定點突變：突變使用定點突變試劑盒，按說明書操作。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建：NOK激酶cDNA全長和HA(人流感病毒血凝素)標(biāo)簽蛋白融合，插入到pcDNA3.0載體的HindⅢ和XbaⅠ位點形成pcDNA-NOK質(zhì)粒；DFG-NOK和FLAG標(biāo)簽蛋白融合，插入到pcDNA3.0載體的HindⅢ和NotⅠ位點形成pcDNA3.0-DFG-NOK質(zhì)粒。pcDNA-DFG-NOK質(zhì)粒的上游引物5′-ATAAGCTTATGGGCATGACACGGATG CT-3′，下游引物5′-ATGCGGCCGCTCACTTATCGT CGTCATCCTTGTAATCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′。PCR反應(yīng)擴(kuò)增30個循環(huán)，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切再亞克隆進(jìn)pcDNA3.0載體，在感受態(tài)大腸桿菌中轉(zhuǎn)化克隆，提取質(zhì)粒并對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序分析。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min收取蛋白，BCA工作液紫外分光光度計檢測蛋白樣品濃度，每孔蛋白上樣量15 μg，100 ℃沸水浴5 min。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，一抗按比例用0.5%牛奶稀釋后4 ℃孵育過夜，用1×TBST洗4次，每次5 min，37 ℃孵育二抗1 h，清洗，ECL發(fā)光液反應(yīng)，暗室曝光。

1.2.5 CCK8法檢測增殖：12孔板培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再將細(xì)胞鋪置96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔加5 μL CCK8溶液，孵育1～2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度值；MTT法：12孔板培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再將細(xì)胞鋪置96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μL MTT溶液，孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO,在37 ℃搖床上振蕩10 min，測定490 nm處吸光度(A)值。

1.2.6 Accuri C6流式檢測細(xì)胞周期：收集2×106個細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 mL預(yù)冷的1×PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入0.3 mL預(yù)冷1×PBS，再逐滴加入3倍體積的4 ℃預(yù)冷的無水乙醇，輕輕振蕩成單細(xì)胞懸液；-20 ℃固定1 h以上；4 000 r/min離心5 min去乙醇，PBS洗兩遍，加100 μL 1×PBS重懸，加100 μL PI染色液避光染色10 min；流式細(xì)胞儀檢測，保存為FCS文件格式，使用Modfit軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.2.7 同源比對：SWISS MODEL是一種同源建模服務(wù)器，根據(jù)NOK氨基酸序列同源構(gòu)建蛋白三級結(jié)構(gòu)，NOK的同源模板為成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)，以FGFR1內(nèi)DFG基序的位置，確定在NOK加入DFG基序的位置。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DFG基序加入NOK的位置

根據(jù)其DFG基序位置確定NOK中DFG基序位置(圖1)。將第269、270位G、L改為D、F，和第271位氨基酸組成DFG基序，對應(yīng)于NOK cDNA第806、807、810位核苷酸G、A、A突變?yōu)锳、C、T。

2.2 DFG-NOK對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響

與瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組相比，瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-DFG-NOK的NIH3T3細(xì)胞組吸光度降低，增殖受到抑制(圖2A,B)(P<0.05)。

2.3 DFG-NOK對NIH3T3細(xì)胞周期G1/S期的影響

與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-DFG-NOK組，G1期所占比例升高，S期所占比例降低。DFG-NOK抑制細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期(圖3)(P<0.05)。

2.4 DFG-NOK對細(xì)胞信號通路和周期蛋白表達(dá)的影響

與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-DFG-NOK組Erk、STAT1、STAT3和JAK3蛋白的磷酸化水平(圖4A～C,E～H) 以及細(xì)胞周期蛋白cyclinD1表達(dá)水平均降低(圖4D, I)。

3 討論

NOK是一種新型受體酪氨酸激酶，包含422個氨基酸，鑲嵌在細(xì)胞膜上，具有完整的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和遠(yuǎn)小于其他受體酪氨酸激酶胞外區(qū)段的胞外區(qū)[5]，它參與多種信號通路的激活，比如RAS-MAPK、PI3K-AKT和JAK-STAT等信號通路[12]。NOK在不同物種或組織器官中異常表達(dá)，人體內(nèi)前列腺中的NOK表達(dá)量最高，小鼠體內(nèi)小腸和結(jié)腸中表達(dá)量最高。293T和HeLa等細(xì)胞系中的NOK表達(dá)高于其他細(xì)胞系[5]。NOK在膠質(zhì)瘤和鼻咽癌中激活PI3K-AKT信號通路[7-8]。此外，NOK對細(xì)胞周期也有重要作用，研究證明NOK可促進(jìn)293T cyclin D1表達(dá)和細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期[13]。

DFG分為兩種構(gòu)像DFG-in和DFG-on，存在于Src和P38等激酶中，對激酶活性起到重要作用[9-11]。比對NOK氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其沒有DFG基序。至今沒有關(guān)于DFG基序和NOK激酶相關(guān)聯(lián)的研究?；谝陨峡蒲斜尘?，展開此項關(guān)于DFG-NOK的研究。

本研究選擇NIH3T3細(xì)胞為研究對象，展開DFG-NOK對細(xì)胞信號通路、細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖影響的研究。實驗發(fā)現(xiàn)，NOK加入DFG基序后抑制增殖信號通路Erk、STAT3、JAK3的磷酸化和周期蛋白cyclin D1的表達(dá)；同時，也抑制NIH3T3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期。因此，推論NIH3T3細(xì)胞增殖的抑制可能是由于p-Erk、p-STAT3和p-JAK3表達(dá)下降引起的；細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期阻滯可能是周期蛋白cyclin D1表達(dá)水平下降引起的，而G1期進(jìn)入S期的抑制也引起細(xì)胞增殖的抑制。STAT1是細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，對于結(jié)果中pcDNA3.0-DFG-NOK抑制p-STAT1表達(dá)原因還不清楚，需進(jìn)一步對NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測。DFG-NOK中GLG突變?yōu)镈FG,甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，非極性氨基酸變?yōu)樗嵝园被幔涟彼嵬蛔優(yōu)楸奖彼?，非極性氨基酸變?yōu)榉枷阕灏被幔被嵝再|(zhì)的改變，致使各氨基酸殘基之間的空間構(gòu)象和相互作用力改變。

A.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0；B.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0-DFG-NOK；C.statistics analysis of the G1/S phase distribution; *P<0.05 compared with pcDNA3.0

A.changes of Akt,p-Akt、Erk,p-Erk protein expression in responding to DFG-NOK over expression； B.changes of STAT1,p-STAT1,STAT3,p-STAT3 protein expression in responding to DFG-OK over expression；C.changes of JAK3,p-JAK3 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；D.changes of cyclinD1 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；E.gray-scale value of p-Erk in responding to DFG-NOK over expression；F.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression；G.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； H.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； I.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with pcDNA3.0 group； #P<0.05 compared with pcDNA3.0-NOK group

本工作雖然證實DFG-NOK抑制NIH3T3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期。但對于DFG-NOK的結(jié)構(gòu)和引起這些作用的機(jī)制還未明確，需做進(jìn)一步研究。