楊旭東，于紅亮，李 靜，趙春華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系，北京 100005)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占全世界每年診斷的癌癥和癌癥相關(guān)死亡的10%，在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)[1-2]。外泌體是幾乎所有細(xì)胞都能分泌的直徑30～200 nm的雙層膜囊泡，含有蛋白、DNA、RNA、脂質(zhì)等多種成分，具有生物學(xué)功能[3]。隨著近些年的不斷研究，外泌體顯示出了在多方面的功能和應(yīng)用，比如減緩衰老，治療少肌癥和阿爾茨海默病[4-6]。

近年來(lái)，巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)腫瘤作用的研究也在逐漸增加。通常，M1型巨噬細(xì)胞的外泌體具有促炎和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，如能增強(qiáng)疫苗的抗腫瘤活性[7]，增強(qiáng)紫杉醇抗腫瘤的效果[8]，而M2型巨噬細(xì)胞的外泌體卻是抑炎和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的[9-10]。J774A.1細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞，有研究證明其表型為M2型[11-12]，目前該細(xì)胞及其外泌體對(duì)結(jié)直腸癌影響及相關(guān)機(jī)制的報(bào)導(dǎo)較少。本研究使用J774A.1的外泌體處理結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38和CT26，觀察它們的增殖、遷移能力及MEK-ERK通路磷酸化水平的變化，初步探索J774A.1的外泌體在結(jié)直腸癌中的作用，以期為人結(jié)直腸癌的治療提供一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和耗材：DMEM高糖、RPMI 1640 和胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(PS)(華北制藥股份有限公司)；0.22 μm濾杯和100 KD超濾管(Millipore公司)；流式抗體CD68和CD206(Proteintech公司)；多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；CCK8試劑盒(Yeasen公司)；Western blot抗體CD63(Proteintech公司), TSG101和CD9(Abcam公司), MEK、p-MEK、ERK和p-ERK(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.2 細(xì)胞：小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1及小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞系MC38和CT26均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：J774A.1細(xì)胞用DMEM高糖+10% FBS+PS培養(yǎng)，MC38細(xì)胞和CT26細(xì)胞用RPMI 1640+10% FBS+PS培養(yǎng)。

1.2.2 J774A.1細(xì)胞表型的鑒定：將J774A.1細(xì)胞用細(xì)胞刮收集，用D-Hank’s緩沖液清洗后于4 ℃孵育一抗30 min，清洗后于4 ℃孵育二抗30 min，清洗后篩網(wǎng)過(guò)濾，流式檢測(cè)CD68和CD206。

1.2.3 超濾法提取外泌體：當(dāng)J774A.1細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集上清至50 mL離心管，2 500 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。離心后的上清用0.22 μm的濾杯在超凈工作臺(tái)中過(guò)濾，之后再用100 KD超濾管在4 ℃超速離心機(jī)中離心以提取外泌體，離心轉(zhuǎn)速?gòu)? 000×g逐漸上升到6 000×g，離心時(shí)間從5 min逐漸上調(diào)到20 min。

1.2.4 透射電鏡鑒定外泌體：1%戊二醛固定外泌體，滴20 μL在銅網(wǎng)上，滴加1%乙酸雙氧鈾負(fù)染2 min，濾紙吸除多余染液，日光燈下干燥1 h后拍照。

1.2.5 結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取：將1 μL 濃度為1 mmol/L的熒光染料DiI加入1 mL含外泌體的RPMI 1640溶液中，將適量混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在不同時(shí)間段(0、6、12、24 h)對(duì)細(xì)胞使用多聚甲醛固定，清洗后加入1 μL Hoechst染料染色，清洗后加入1 mL緩沖液，拍照。

1.2.6 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖：將MC38和CT26細(xì)胞分別按2 000個(gè)/孔接種于96孔板，第1～3天內(nèi)檢測(cè)，加入10% CCK8培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值。按CCK8試劑盒說(shuō)明書計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將細(xì)胞按5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合至90%時(shí)，用10 μL的槍頭進(jìn)行劃痕，用緩沖液清洗3次。外泌體濃度為300 μg/mL，在不同時(shí)間點(diǎn)(如0、12、18、24、36 h)顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.8 Western blot檢測(cè)蛋白：將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板，過(guò)夜換新鮮培養(yǎng)基且添加外泌體，外泌體濃度為300 μg/mL，處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MEK-ERK信號(hào)通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 J774A.1細(xì)胞表型及其外泌體的鑒定

小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1貼壁生長(zhǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表型為CD68+CD206+(圖1A)，說(shuō)明其為M2型巨噬細(xì)胞。按照超濾的方法提取J774A.1細(xì)胞的外泌體。透射電鏡觀察到外膜深染的圓形或類圓形的微囊泡，直徑為30～140 nm(圖1B)。納米顆粒追蹤分析NTA顯示囊泡的直徑分布范圍，峰值在126.6 nm處(圖1C)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明這些微囊泡陽(yáng)性表達(dá)外泌體的標(biāo)志蛋白TSG101、CD63和CD9(圖1D)。以上結(jié)果符合外泌體的基本特征。

A.flow cytometry was used to identify the phenotype of J774A.1； B.transmission electron microscopy was used to detect the morphology of J774A.1 exosome； C.NTA was used to assess the diameter size of J774A.1 exosome； D.Western blot was used to detect the surface markers of J774A.1 exosome

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38和CT26攝取J774A.1的外泌體

分別在0、6、12和24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MC38和CT26對(duì)外泌體的攝取量逐漸增加，24 h時(shí)達(dá)到高峰(圖2)。

圖2 MC38及CT26攝取J774A.1外泌體Fig 2 Uptake of J774A.1 exosome by MC38 and CT26

2.3 J774A.1細(xì)胞的外泌體促進(jìn)MC38和CT26細(xì)胞增殖

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，用不同濃度外泌體處理24～72 h后，相比于MC38細(xì)胞的對(duì)照組，外泌體的所有濃度處理組的細(xì)胞增殖均顯著增加(P<0.05)，且存在一定的濃度和時(shí)間依賴性(圖3)。而相比于CT26細(xì)胞的對(duì)照組，外泌體的高濃度處理組(50～300)μg/mL的細(xì)胞增殖也都明顯增加(P<0.05)，并且呈一定的濃度和時(shí)間依賴性(圖3)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 μg/mL group圖3 CCK8法檢測(cè)MC38和CT26的增殖能力Fig 3 Proliferation of MC38 and CT26 was detected by CCK8

2.4 J774A.1細(xì)胞的外泌體促進(jìn)MC38及CT26細(xì)胞的遷移能力

無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，隨著時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，加入外泌體的實(shí)驗(yàn)組MC38細(xì)胞和CT26細(xì)胞的遷移率均明顯增加(圖4)。

圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MC38和CT26的遷移能力Fig 4 Migration ability of MC38 and CT26 was detected by wound healing assay

2.5 J774A.1細(xì)胞的外泌體對(duì)增殖遷移相關(guān)信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)增殖遷移相關(guān)的MEK-ERK信號(hào)通路的結(jié)果顯示，p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)水平升高(圖5)。

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)MC38和CT26中MEK-ERK信號(hào)通路的活化情況Fig 5 The activation of MEK-ERK signaling pathway in MC38 and CT26 was detected by Western blot

3 討論

惡性腫瘤具有無(wú)限增殖、抗凋亡、促進(jìn)炎性反應(yīng)、向組織侵襲和轉(zhuǎn)移等能力，其并發(fā)癥所帶來(lái)的危害會(huì)造成患者身心的巨大痛苦和醫(yī)療費(fèi)用上的沉重負(fù)擔(dān)，所以腫瘤治療具有非常重要的意義。腫瘤組織由腫瘤細(xì)胞及其賴以生存的腫瘤微環(huán)境組成，腫瘤微環(huán)境含有免疫細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子等。外泌體也屬于腫瘤微環(huán)境，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。

結(jié)直腸癌是威脅人類健康和生命的一大惡性腫瘤，具有相當(dāng)高的發(fā)病率和病死率。本研究探討了小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1分泌的外泌體對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系MC38和CT26的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示增殖遷移能力的增強(qiáng)在機(jī)制上可能是通過(guò)激活MEK-ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。通常情況下，外泌體可以通過(guò)microRNA或蛋白等成分作用于信號(hào)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)功能[10,13]。所以值得進(jìn)一步研究的是，J774A.1外泌體是通過(guò)何種分子成分活化的此通路。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索，M2型巨噬細(xì)胞的外泌體對(duì)結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、胰腺導(dǎo)管癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌有促進(jìn)作用。MEK-ERK是腫瘤細(xì)胞增殖遷移的一條常見(jiàn)通路，但是迄今未發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的外泌體通過(guò)此通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的報(bào)導(dǎo)。此外，有研究表明，M2型巨噬細(xì)胞外泌體可通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。實(shí)際上，腫瘤和巨噬細(xì)胞之間的作用是相互的，腫瘤的外泌體也能對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生非常重要的影響[15]。比如，結(jié)直腸癌的外泌體能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，而極化的巨噬細(xì)胞能促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和分泌生長(zhǎng)因子、趨化因子等,促進(jìn)癌癥的發(fā)展與轉(zhuǎn)移[14,16]。

隨著研究的深入，相信外泌體的結(jié)構(gòu)和組分會(huì)得到不斷的解析，在外泌體表面的分子修飾及其內(nèi)部成分的可控變化，將使外泌體在疾病治療上的作用得到極大的進(jìn)步。而且巨噬細(xì)胞與腫瘤關(guān)系密切，二者之間的作用也許能幫助我們較好地理解巨噬細(xì)胞外泌體的功能及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。綜上所述，M2型巨噬細(xì)胞J774A.1的外泌體有望成為結(jié)直腸癌上分子靶向治療研究的一個(gè)新工具。