潘 永，段世宇，楊 陽，楊 琦,3*

（1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium LT2，STM LT2）是引起人類和牲畜食源性疾病的主要病原之一，人類感染沙門菌會引起發(fā)燒、腸胃炎、敗血癥等，對社會經(jīng)濟(jì)和人類健康造成了很大影響[1]。目前細(xì)菌種群向耐藥表型快速進(jìn)化導(dǎo)致缺乏抗擊耐藥菌株的新型藥物[2-3]，給該病防控帶來很大困難。

小RNA（small RNA，sRNA）是調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的非編碼RNA，sRNA 分子通常長40～400 個核苷酸[4-5]。sRNA 可以通過與mRNA 翻譯起始靶位點(diǎn)結(jié)合。從而隔離核糖體備用結(jié)合位點(diǎn)或通過改變靶mRNA 二級結(jié)構(gòu)暴露核糖核酸酶作用位點(diǎn)促進(jìn)mRNA 降解來抑制的翻譯。其還可以通過暴露螯合的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或通過掩蓋核糖核酸酶的切割位點(diǎn)來保護(hù)mRNA，從而激活其翻譯[6-8]。此外，最近的研究表明，大約一半的mRNA 受sRNA 調(diào)控[9]。鑒于此，基于sRNA 介導(dǎo)的廣泛調(diào)控促使合成sRNA 被作為新型抗菌藥物來研究。研究表明，sRNA GcvB通過調(diào)控抗生素吸收所需基因來調(diào)節(jié)大腸桿菌抗生素抗性[4]。而STM LT2 與大腸桿菌中的gcvB 基因序列具有較高的同源性，其直接或間接影響STM LT2至少20%的基因表達(dá)，經(jīng)驗(yàn)證其直接調(diào)控的靶mRNA 近30 個，其中大部分與STM LT2 氨基酸的攝取有關(guān)， 普遍認(rèn)為GcvB 與細(xì)菌在高營養(yǎng)環(huán)境下避免多余能量的消耗相關(guān)[9]。研究表明，STM GcvB 存在3 個不同的功能基序，R1（TGTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGCAA）、R2（ACTTCCTGTA）和R3（TACC CTGTCTGTCCATAGTGATTAAT）[10-11]，而受這些功能基序直接調(diào)控的靶mRNA 均能與R1、R2 或R3 產(chǎn)生完全或部分的堿基互補(bǔ)配對[10-11]。另外，GcvB 在STM LT2 對數(shù)早期表達(dá)量最高，之后逐漸降低，穩(wěn)定期時幾乎檢測不到。

因此，本研究針對對數(shù)生長早期的STM LT2 進(jìn)行研究[12]，利用TARGET2 程序分別預(yù)測STM LT2 中能與GcvB R1、R2 或R3 功能基序產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對的靶基因，并進(jìn)一步通過熒光定量PCR 檢測STM LT2 經(jīng)預(yù)測靶基因在其匹配功能基序敲除菌株、gcvB 基因敲除菌株以及野生型菌株中轉(zhuǎn)錄水平的變化，旨在探索更多STM LT2 sRNA GcvB 直接調(diào)控靶標(biāo)，為進(jìn)一步研究STM LT2 致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料野生型STM LT2 株MA3409[13]、STM LT2/pKD46 株MA7455[13]、 STM LT2 ΔgcvB 株MA10241[14]、pKD3[15]和pKD46[15]質(zhì)粒均由法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi 實(shí)驗(yàn)室惠贈；pfu 和Taq DNA 聚合酶均購自北京索萊寶科技有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和RNA 提取試劑TRIzol 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）以及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌總DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 STM LT2 GcvB 靶基因的預(yù)測登陸網(wǎng)站（http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/），輸入分析對象（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2），分別輸入GcvB R1 功能基序（TGTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGCAA）、R2 功能基序（ACTT CCTGTA）和R3 功能基序（TACCCTGTCTGTCCATAGTGATTAAT）[10-11]， 其它各項(xiàng)指標(biāo)均按程序默認(rèn)值設(shè)定，mRNA 匹配區(qū)域?yàn)?80～+20 nt，sRNA 窗口大小為20，最小雜交種子為7，p值最大閾值為0.05，過濾尺寸為400，點(diǎn)擊搜索并導(dǎo)出預(yù)測與GcvB R1、R2 或R3功能基序所匹配的靶基因結(jié)果[16]。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成如表1 所示，參照Gene-Bank 中相關(guān)序列，利用primerselect 軟件設(shè)計(jì)引物，單橫線表示堿基序列與MA3409 同源，雙橫線表示堿基與pKD3 質(zhì)粒中氯霉素抗性基因序列同源，F(xiàn)gcvB-R1、FgcvB-R2 和FgcvB-R3 引物已分別刪除gcvB 基因R1、R2 和R3 功能基序，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 菌株的構(gòu)建將氯霉素抗性基因克隆至gcvB 基因下游，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供抗性篩選標(biāo)記[15]。以ppF/ppR 為上下游引物，pKD3 為模板，PCR 擴(kuò)增氯霉素抗性基因片段并經(jīng)純化回收產(chǎn)物。取5 μL 產(chǎn)物與50 μL MA7455 感受態(tài)細(xì)胞混合并進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，次日挑取單個重組菌落以t1 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測序鑒定，鑒定正確的菌株命名為STM LT2 gcvB::cat。

以STM LT2 gcvB::cat 菌株總DNA 為模板，分別以FgcvB-R1/ppR、FgcvB-R2/ppR 和FgcvB-R3/ppR 為引物PCR 擴(kuò)增同源重組基因片段并經(jīng)純化后回收產(chǎn)物。采用上述方法，將不同的同源重組基因片段分別電轉(zhuǎn)化至MA7455 感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單個重組菌落以t1 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測序鑒定，鑒定正確的菌株分別命名為STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3。

1.5 預(yù)測靶基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR 檢測根據(jù)TRIzol 說明書分別提取對數(shù)早期（OD600nm≈0.4）的MA3409、MA10241、STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 菌株總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。檢測經(jīng)預(yù)測靶基因熒光定量PCR 引物特異性后，通過熒光定量PCR分別檢測靶基因在其匹配功能基序敲除菌株（STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 或STM LT2 gcvBΔR3 菌 株）、MA3409 和MA10241 中轉(zhuǎn)錄水平的變化，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s。每個樣設(shè)3 個重復(fù), 以16S rRNA 作為內(nèi)參基因，結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算[17]。

2 結(jié) 果

2.1 STM LT2 GcvB 靶基因的預(yù)測結(jié)果利用TargetRNA2 程序預(yù)測能與STM LT2 GcvB R1、R2 或R3功能基序堿基互補(bǔ)配對的靶基因。結(jié)果顯示，共預(yù)測到6 個能與GcvB R1 功能基序形成至少10 個連續(xù)堿基互補(bǔ)配對的靶基因，5 個能與GcvB R2 功能基序形成至少7 個連續(xù)堿基互補(bǔ)配對的靶基因，5 個能與GcvB R3 功能基序形成至少7 個連續(xù)堿基互補(bǔ)配對的靶基因，且所有預(yù)測結(jié)果p 值均小于0.05，均符合預(yù)設(shè)值標(biāo)準(zhǔn)（表2）。以上結(jié)果表明，本研究共預(yù)測到GcvB 靶基因16 個，包括與GcvB R1 功能基序匹配的6個靶基因STM1856、metF、mltC、sbp、yhhT 和yaeC；與GcvB R2 功能基序匹配的5 個靶基因narY、sgbE、ybbP、speG和ybbA；以及與GcvB R3功能基序匹配的5個靶基因gshA、STM0849、yihU、ampH和aroF。

2.2 STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2 和STM LT2gcvBΔR3 菌株的構(gòu)建結(jié)果通過同源重組將氯霉素抗性基因克隆至STM LT2 gcvB 基因下游并進(jìn)行PCR 及測序鑒定。PCR 鑒定結(jié)果顯示，STM LT2 gcvB::cat 重組菌株出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的條帶（圖1A）；測序結(jié)果顯示，STM LT2 gcvB::cat 重組菌株的目的條帶大小為1 910 bp，與預(yù)期大小完全相符。表明STM LT2 gcvB::cat 菌株已正確構(gòu)建。

以STM LT2 gcvB::cat 菌株總DNA 為模板分別擴(kuò)增STM LT2 gcvB 基因R1、R2 和R3 基序缺失基因片段，通過同源重組構(gòu)建STM LT2 GcvB 不同基序敲除菌株并進(jìn)行PCR 及測序鑒定。PCR 鑒定結(jié)果顯示,STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 重組菌株均出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的條帶（圖1B），測序結(jié)果顯示，STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 重組菌株的目的條帶大小分別為1 886 bp、1 901 bp 和1 884 bp，與預(yù)期完 全 相 符。 表 明STM LT2 gcvBΔR1、 STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 菌株均已正確構(gòu)建。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the paper

表2 TargetRNA2 程序預(yù)測能與GcvB 3 個功能基序堿基配對的靶基因Table 2 Predicted target genes base-paired to the three functional motifs of GcvB using the TargetRNA2 program

圖1 重組菌株的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of recombinant strain

2.3 預(yù)測靶基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR 檢測結(jié)果通過熒光定量PCR 分別檢測預(yù)測靶基因在其匹配功能基序敲除菌株（STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 或STM LT2 gcvBΔR3 菌 株）、MA3409 和MA10241 中轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)預(yù)測能與GcvB R1 功能基序相互作用的6 個靶基因中，STM1856、metF、mltC 和sbp 基 因 在gcvB 基 因 或gcvB R1 功能基序被敲除后轉(zhuǎn)錄水平相對野生型菌株下調(diào)均超過200%（圖2A）；經(jīng)預(yù)測能與GcvB R2 功能基序相互作用的5 個靶基因中，ybbP 和speG 基因在gcvB 基因或gcvB R2 功能基序被敲除后轉(zhuǎn)錄水平相對野生型菌株下調(diào)均超過200%（圖2B）；預(yù)測能與GcvB R3 功能基序相互作用的5 個靶基因中，ampH、gshA 和aroF 基因在gcvB 基因或gcvB R3 功能基序被敲除情況后轉(zhuǎn)錄水平相對野生型菌株下調(diào)均超過200%（圖2C）。另外，MA10241 未檢測到gcvB 基因轉(zhuǎn)錄，STM LT2 gcvBΔR1、STM LT2 gcvBΔR2 和STM LT2 gcvBΔR3 菌株均檢測到gcvB 基因轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平與MA3409 相比無顯著差異。結(jié)果表明，經(jīng)預(yù)測靶 基 因STM1856、metF、mltC、sbp、ybbP、speG、ampH、gshA 和aroF 在轉(zhuǎn)錄水平受sRNA GcvB 的正調(diào)控，其中對STM1856、metF、mltC 和sbp 基因的調(diào)控與GcvB R1 基序存在顯著關(guān)聯(lián)（p＜0.05）；對ybbP和speG 基因的調(diào)控與GcvB R2 基序存在顯著關(guān)聯(lián)（p＜0.05）；對ampH、gshA 和aroF 基 因 的 調(diào) 控 與GcvB R3 基序存在顯著關(guān)聯(lián)（p＜0.05）。

本研究預(yù)測并驗(yàn)證的基因STM1856、metF、mltC、sbp、ybbP、speG、ampH、gshA 和aroF 分別編碼推定的胞質(zhì)蛋白、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶、膜結(jié)合的溶血性尿素轉(zhuǎn)糖基化酶C、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、推定的內(nèi)膜蛋白、亞精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶、青霉素結(jié)合蛋白、gamma-谷氨酸-半胱氨酸連接酶以及3-脫氧-D-阿拉伯庚基庚酸酯-7-磷酸鹽合酶，這些基因均顯著受GcvB 正調(diào)控。

圖2 預(yù)測靶基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR 檢測結(jié)果Fig.2 Real-time qPCR analysis detection results of predicted target gene transcription levels

3 討 論

以往研究主要通過對比和分析STM LT2 敲除hfq或gcvB 基因后轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平的變化，以此為基礎(chǔ)篩選出差異表達(dá)較明顯的基因。雖然基于該方法已經(jīng)鑒定了許多GcvB 靶基因，但仍存在一些不足，如篩選基因總數(shù)太大，對GcvB 直接調(diào)控靶基因的驗(yàn)證存在很大的不確定性等。而通過大量的研究表明，GcvB 主要通過3 個功能基序與靶基因作用，并且許多靶基因與GcvB 的作用方式存在相同或類似的特點(diǎn)。本研究針對GcvB 3 個不同的功能基序，采用TargetRNA2 程序預(yù)測到16 個靶基因，其中9 個基因的研究結(jié)果表明，GcvB 可能直接調(diào)控這些基因。顯然，這種針對研究對象特性并結(jié)合軟件預(yù)測的研究方法有較高的篩選效率。

盡管熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示部分預(yù)測靶基因在不同的兩種重組菌株中差異表達(dá)趨勢相同，但也同時出現(xiàn)一些值得探究的現(xiàn)象。3 組熒光定量PCR 結(jié)果中，經(jīng)預(yù)測靶基因在GcvB 不同功能基序的單敲除菌株中的差異表達(dá)程度總是強(qiáng)于完整gcvB 基因敲除菌株。除此之外，相同經(jīng)預(yù)測靶基因在gcvB基因和GcvB 不同功能基序的單敲除菌株中出現(xiàn)不同的差異表達(dá)趨勢，如yaeC 和yihU 基因。這些現(xiàn)象提示，GcvB 不同功能基序存在各自的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能擁有密切的聯(lián)系。Pulvermacher等對大腸桿菌GcvB 靶基因cycA 的研究中發(fā)現(xiàn)，GcvB可能通過多個冗余序列與靶基因結(jié)合[18]。盡管目前為止尚不清楚其中機(jī)制，但這提示GcvB 功能基序的作用機(jī)制較為復(fù)雜，有待深入研究。另外，Hfq 在不存在sRNA 的情況下仍能調(diào)控靶基因的表達(dá)，上述現(xiàn)象的產(chǎn)生或許與Hfq 的干擾有關(guān)，有待進(jìn)一步確認(rèn)。

GcvB 的負(fù)調(diào)控機(jī)制通常通過借助伴侶蛋白Hfq與靶mRNA 堿基配對來抑制基因表達(dá)，與mRNA 的作用區(qū)域通常位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)或鄰近上游富含ACA 的增強(qiáng)子序列[19-20]。GcvB 的正調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，目前主要存在兩種通用機(jī)制，第一種機(jī)制通過sRNA 與mRNA 堿基互補(bǔ)配對將固有的翻譯抑制結(jié)構(gòu)展開，結(jié)果使核糖體與mRNA 順利結(jié)合而增強(qiáng)翻譯；另一種機(jī)制最為常見，sRNA 通過與mRNA 堿基配對相互作用干擾核糖核酸酶對mRNA 的降解，這種相互作用主要發(fā)生在mRNA Shine-Dalgarno（SD）序列到開放閱讀框（ORF）中的第5 個密碼子[21-22]。TargetRNA2 程序?qū)TM1856、metF、mltC、sbp、ybbP、speG、ampH、gshA 和aroF 基因的預(yù)測結(jié)果顯示各基因均存在與至少一個GcvB 功能基序堿基互補(bǔ)配對的區(qū)域，并且相互作用區(qū)域均位于mRNA Shine-Dalgarno（SD）序列到起始密碼子之間，因此，推測GcvB 對STM1856、metF、mltC、sbp、ybbP、speG、ampH、gshA 和aroF 基因的正調(diào)控可能是基于干擾核糖核酸酶對mRNA 的降解而產(chǎn)生的，這是已報(bào)道最普遍的GcvB 正向調(diào)節(jié)靶基因的作用機(jī)理。

本研究預(yù)測并驗(yàn)證了16 個GcvB 靶基因，其中STM1856、metF、mltC、sbp、ybbP、speG、ampH、gshA 和aroF 基因均受GcvB 的正向調(diào)控，為進(jìn)一步闡述GcvB 在STM LT2 中的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。