宋 茜，黃 雪*，覃蒙斌，張君紅，井 潔，羅毅華，李雨芯

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年病學(xué)消化科, 廣西壯族自治區(qū) 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道的慢性非特異性炎性疾病[1]。UC的發(fā)病機(jī)制與腸屏障損傷密切相關(guān)[2-3]。腸上皮屏障是腸屏障最重要的組成成分，而緊密連接在腸上皮屏障中發(fā)揮著重大作用。緊密連接蛋白是形成緊密連接的主干[4-5]，由跨膜蛋白o(hù)ccludin、claudins、胞內(nèi)支架蛋白ZO、連接黏附分子JAM等蛋白組成[6]，細(xì)胞因子在緊密連接的調(diào)控中起著重要作用，包括IL-10等[7]。而IL-22作為2000年發(fā)現(xiàn)的與IL-10相關(guān)的一種新型細(xì)胞因子[8]，長期以來被認(rèn)為是UC組織修復(fù)的重要介質(zhì)[9]，IL-22能通過活化STAT3通路在UC中起保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為修復(fù)黏膜創(chuàng)口、阻止腸腔菌群移位和刺激腸上皮細(xì)胞、潘氏細(xì)胞分泌多種抗菌肽等[10]，但其對腸上皮屏障中緊密連接的影響及機(jī)制尚不明確。此研究主要探討IL-22對HT29細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)的影響及其是否通過STAT3通路參與調(diào)控，旨在更全面的了解IL-22在腸上皮屏障功能調(diào)節(jié)中的作用，為尋找治療UC的新藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 試劑與試劑盒：胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(Biological Industries公司)；TBST緩沖液(Solarbio公司)；IL-22(Peprotech公司)；STAT3通路抑制劑FLLL32和STAT3通路激活劑colivelin(APE-BIO公司)；LV-STAT3-RNAi病毒和shNC陰性對照病毒(吉?jiǎng)P基因)；claudin-1和claudin-2抗體(Abcam公司)；ZO-1抗體(Millipor公司)；occludin、STAT3、p-STAT3和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)；鼠二抗和兔二抗(Earthox公司)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ試劑盒和PCR引物序列(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HT29細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為1)對照組：未處理；2)IL-22組：給予100 ng/mL的IL-22處理24 h；3)FLLL32組：用10 μmol/L的FLLL32對HT29細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h后給予100 ng/mL的IL-22干預(yù)24 h；4)colivelin組：用0.5 μmol/L 的colivelin 對HT29細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h后給予100 ng/mL的IL-22干預(yù)24 h；5)shNC組：轉(zhuǎn)染陰性對照病毒；6)shNC+IL-22組：轉(zhuǎn)染陰性對照病毒后給予100 ng/mL的IL-22干預(yù)24 h；7)shSTAT3組：轉(zhuǎn)染LV-STAT3-RNAi；8)shSTAT3+IL-22組：轉(zhuǎn)染LV-STAT3-RNAi后給予100 ng/mL的IL-22干預(yù)24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待細(xì)胞匯合度達(dá)70 %左右時(shí)，參照吉?jiǎng)P基因慢病毒轉(zhuǎn)染說明書步驟將LV-STAT3-RNAi及其陰性對照根據(jù)分組轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞中。

1.2.2 Western blot檢測STAT3、p-STAT3、ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2蛋白：提取各組細(xì)胞總蛋白，上樣至SDS-PAGE凝膠中電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。使用含5%脫脂奶粉封閉1 h，加入配好的一抗在4 ℃下孵育過夜(claudin-1、claudin-2、ZO-1、GAPDH、occludin、STAT3和p-STAT3抗體)，使用TBST緩沖液清洗后放入配置好的二抗中避光孵育1 h。TBST緩沖液清洗后將PVDF膜置于Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描、顯影，保存并使用imageJ軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 Real-time PCR 檢測STAT3、ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2的mRNA：使用RNAiso Plus提取各組細(xì)胞中的RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI 7500 real-time PCR system進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過2-△△Ct方法計(jì)算。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞間緊密連接：在各組細(xì)胞中加入2.5%的常溫戊二醇固定液，常溫避光固定5 min，使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，1 500 r/min離心2 min，收集各組細(xì)胞后，使用固定液避光固定30 min,4 ℃保存，用于后續(xù)透射電鏡觀察，拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IL-22對HT29細(xì)胞中緊密連接的影響

與對照組相比，IL-22組緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2的表達(dá)及其mRNA的表達(dá)量均被上調(diào)(圖1A～C，P<0.05)，電鏡下可觀察到，相比于對照組，IL-22組的緊密連接更致密，細(xì)胞間間隙較狹窄(圖1D)。

A.immunoblotting map; B.effect of IL-22 on protein expression in HT29 cells; C.effect of IL-22 on mRNA expression in HT29 cells; D.transmission electron microscopy observation of tight junctions between HT29 cells(×12 000), arrows indicate tight junction; *P<0.05 compared with control group

2.2 STAT3和p-STAT3在IL-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中的表達(dá)

與對照組相比，IL-22組STAT3和p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 抑制STAT3通路對IL-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中緊密連接的影響

與IL-22組相比，F(xiàn)LLL32組STAT3和p-STAT3表達(dá)量減少(圖3，P<0.05)，緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(圖4，P<0.05)，電鏡下觀測到FLLL32組細(xì)胞間間隙較寬(圖5)。

2.4 激活STAT3通路對IL-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中緊密連接的影響

與IL-22組相比，colivelin組STAT3和p-STAT3表達(dá)量增加(圖3，P<0.05)，緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表達(dá)水平上調(diào)(圖4，P<0.05)，電鏡下觀測colivelin組緊密連接更致密，細(xì)胞間間隙較狹窄(圖5)。

2.5 沉默STAT3基因后IL-22不能對HT29細(xì)胞中的緊密連接起保護(hù)作用

相比于shNC組，shSTAT3組STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(圖6，P<0.05)；相比于shNC+ IL-22組，shSTAT3+ IL-22組p-STAT3的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(圖6，P<0.05)。與shNC組相比，shNC+ IL-22組的緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表達(dá)量明顯增加(圖7A～C，P<0.05)，電鏡下觀測到緊密連接更致密(圖8)。而相比于shSTAT3組，shSTAT3+IL-22組的所有緊密連接的蛋白及mRNA表達(dá)量均無明顯差異，細(xì)胞間間隙也無明顯差異(圖7，8)。

A.immunoblotting map; B.effect of IL-22 on protein expression in HT29 cells; *P<0.05 compared with control group圖2 STAT3和p-STAT3在IL-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 Expression of STAT3 and p-STAT3 in IL-22-interfered HT29 n=9)

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with IL-22 group

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with IL-22 group

arrows indicate tight junction圖5 透射電鏡觀察抑制STAT3通路及激活STAT3通路對IL-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中緊密連接的影響

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups;*P<0.05 compared with shNC group; #P<0.05 compared with shNC+ IL-22 group

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with shNC group; #P<0.05 compared with shNC+ IL-22 group

arrows indicate tight junction圖8 透射電鏡觀察沉默STAT3基因?qū)L-22干預(yù)的HT29細(xì)胞中緊密連接的影響

3 討論

緊密連接與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，UC大鼠模型組與正常對照組比較,緊密連接蛋白 occludin的表達(dá)水平顯著降低,且與UC炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)[11]。促炎性細(xì)胞因子 TNF-α和 IFN-γ 可通過下調(diào)緊密連接從而破壞UC的腸黏膜屏障功能[12]，說明緊密連接蛋白表達(dá)異常是UC的重要表現(xiàn)。而保護(hù)腸上皮屏障緊密連接是一種能夠改善UC臨床癥狀的潛在治療方法。

用IL-22處理HT29細(xì)胞后緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1、 claudin-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞間緊密連接更致密，提示IL-22對緊密連接起保護(hù)作用。此結(jié)果與報(bào)道[13]的IL-22可通過增強(qiáng)腸道屏障完整性在UC中發(fā)揮有益作用相似。STAT3通路被認(rèn)為是IL-22最主要的傳導(dǎo)通路，其中STAT3的磷酸化是STAT3活化的標(biāo)志，且是UC發(fā)病機(jī)制中的重要炎性反應(yīng)事件[14]。研究中成功抑制STAT3通路后，IL-22處理的HT29細(xì)胞緊密連接蛋白及其mRNA表達(dá)降低，緊密連接疏松，而成功激活STAT3通路后，IL-22處理的HT29細(xì)胞緊密連接蛋白及其mRNA表達(dá)升高，緊密連接致密，提示STAT3通路參與IL-22上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)及保護(hù)其緊密連接的過程。且在成功沉默HT29細(xì)胞中STAT3基因后發(fā)現(xiàn)，IL-22不能上調(diào)緊密連接蛋白及其mRNA，這進(jìn)一步證明了STAT3通路參與這一過程。此結(jié)果與報(bào)道[10]的IL-22可通過STAT3通路在UC中起保護(hù)作用的觀點(diǎn)相似。

總之，IL-22可以增強(qiáng)HT29細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腸上皮屏障的完整性，STAT3信號(hào)通路參與這一過程。