高洪婷，黃雨晴，楊黎星，馬 瑞，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京 100005)

結(jié)腸癌(colon cancer)是目前世界上常見的癌之一[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病往往具有隱匿性，通常在疾病中晚期才會被發(fā)現(xiàn)，迄今為止臨床上尚無有效的根治性治療方法。因此，探索更加有效的治療結(jié)腸癌的方法和策略，對人類早日擺脫結(jié)腸癌困擾具有重要意義。

羧胺三唑(carboxyamidotriazole，CAI)是一種非細(xì)胞毒類小分子抗腫瘤藥物[2]。研究表明，CAI可以抑制鈣離子內(nèi)流[3]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成并調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[4]，同時(shí)該藥物具有抗感染作用[5]。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)極其復(fù)雜的系統(tǒng)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，針對腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)的腫瘤免疫療法已逐漸成為一種新的治療手段[6]。脾臟是機(jī)體中最大的免疫器官，含有大量淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，在免疫平衡和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。目前，CAI對脾臟淋巴細(xì)胞抑瘤作用的影響尚不明確。本研究擬通過觀察CAI對結(jié)腸癌細(xì)胞系存活和凋亡的影響以及CAI對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抑制結(jié)腸癌細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的影響，初步探究其作用機(jī)制，以期為結(jié)腸癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠(6～8周齡，SPF級，雌性，體質(zhì)量18～20 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動物中心)。常溫環(huán)境飼養(yǎng)(溫度22 ℃±2 ℃，濕度 40%～70%)，12 h明/暗交替。動物自由攝食、飲水。

1.1.2 細(xì)胞系：結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38和C26(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 藥品與試劑：羧胺三唑(CAI)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(深圳市達(dá)科為生物工程有限公司)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CD4流式抗體、CD8流式抗體和CD3流式抗體(BioLegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理：將MC38細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，C26細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中。按小鼠淋巴細(xì)胞分離液說明書分離C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，將與MC38細(xì)胞同品系的C57BL/6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與MC38細(xì)胞按照20∶1的比例共培養(yǎng)，將與C26細(xì)胞同品系的BALB/c小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與C26細(xì)胞按照20∶1的比例共培養(yǎng)。不同濃度CAI處理細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活：在96孔板中分別接種MC38和C26細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的CAI，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48和72 h；或待細(xì)胞貼壁后與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，1 h后加入不同濃度的CAI，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。隨后棄去孔中原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，4 ℃，300×g離心5 min收集細(xì)胞。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，每次均4 ℃，300×g離心5 min，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞。吸棄PBS，加入100 μL 1×緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μL annexin V-FITC和10 μL PI染色溶液，輕輕混勻。避光，室溫反應(yīng)10～15 min。加入400 μL 1×緩沖液，混勻后放置于冰上，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD3+T細(xì)胞和CD8+CD3+T細(xì)胞的比例：收集細(xì)胞至離心管中，室溫，250×g離心10 min，PBS清洗細(xì)胞1次。加入流式抗體，4 ℃ 避光孵育30 min，PBS洗1遍，350 μL PBS重懸細(xì)胞，過篩后流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CAI抑制MC38和C26細(xì)胞存活

不同濃度CAI處理MC38或C26細(xì)胞48、72 h后，A值顯著低于0 μmol/L組(P<0.05、P<0.01和P<0.001)(圖1)。

2.2 CAI增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抑制MC38和C26細(xì)胞存活

MC38和C26細(xì)胞分別與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，A值顯著降低(P<0.001)；不同濃度CAI處理共培養(yǎng)條件下的MC38或C26細(xì)胞48 h后，與單獨(dú)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞處理相比，A值進(jìn)一步顯著降低(P<0.001)；活細(xì)胞數(shù)目相比單獨(dú)培養(yǎng)的MC38或C26細(xì)胞同劑量CAI組的減少比例，超過小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少比例(圖2)。

2.3 CAI促進(jìn)MC38和C26細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞促進(jìn)MC38和C26細(xì)胞凋亡

不同濃度CAI處理MC38或C26細(xì)胞48 h后，凋亡率顯著高于0 μmol/L組(P<0.01和P<0.001)；MC38和C26細(xì)胞分別與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，凋亡率顯著升高(P<0.001)；不同濃度CAI處理共培養(yǎng)條件下的MC38和C26細(xì)胞48 h后，與單獨(dú)處理小鼠脾臟淋巴細(xì)胞相比，凋亡率進(jìn)一步顯著升高(P<0.05和P<0.001)；細(xì)胞凋亡相比單獨(dú)培養(yǎng)的MC38或C26細(xì)胞同劑量CAI組的增加比例，超過小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞凋亡的增加比例(圖3)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖1 CAI對MC38和C26細(xì)胞存活的影響Fig 1 Effects of CAI on the survival of MC38 and C26 n=3)

*P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖2 CAI對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抑制MC38和C26細(xì)胞存活的影響Fig 2 Effects of CAI on that spleen lymphocytes of mice inhibit the survival of MC38 and C26 n=3)

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖3 CAI對MC38和C26細(xì)胞凋亡的影響以及CAI對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞促進(jìn)MC38和C26細(xì)胞凋亡的影響

2.4 CAI升高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD3+ T細(xì)胞和CD8+CD3+ T細(xì)胞的比例

不同濃度CAI處理小鼠脾臟淋巴細(xì)胞48 h后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD3+T細(xì)胞和CD8+CD3+T細(xì)胞的比例顯著升高(P<0.05，P<0.01)(圖4)。

3 討論

CAI是一種非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物，在體內(nèi)外均能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究通過檢測MC38和C26細(xì)胞的存活和凋亡，證實(shí)了CAI對結(jié)腸癌細(xì)胞MC38和C26存活的抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，更重要的是發(fā)現(xiàn)了CAI能夠在體外促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。

近年來，腫瘤微環(huán)境已逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。靶向腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫療法發(fā)展迅速，在惡性腫瘤治療中顯示出強(qiáng)大優(yōu)勢[7]，同時(shí)也面臨眾多機(jī)遇與挑戰(zhàn)[8]。其中，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)是腫瘤組織中的浸潤型淋巴細(xì)胞，可對腫瘤細(xì)胞起到特定的殺傷作用。研究表明，CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞亞群與肺癌患者TILs高密度、細(xì)胞毒性增強(qiáng)和生存率提高有關(guān)[9]。文獻(xiàn)提示，在原發(fā)性腫瘤中，T淋巴細(xì)胞浸潤是無復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立預(yù)后因素[10]。本研究證實(shí)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞使MC38和C26細(xì)胞的凋亡率顯著升高，腫瘤細(xì)胞的存活受到明顯抑制。CAI進(jìn)一步加強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的抑瘤作用，使大量腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)晚凋和壞死狀態(tài)，活細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明CAI促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞主要是通過增加MC38和C26細(xì)胞晚期凋亡以及壞死比例來實(shí)現(xiàn)的，顯示出CAI在腫瘤免疫治療上的潛力。進(jìn)一步檢測后發(fā)現(xiàn)CAI增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抑瘤作用可能與上調(diào)CD4+CD3+T細(xì)胞和CD8+CD3+T細(xì)胞的比例有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討。

*P<0.05,**P<0.01 compared with 0 μmol/L group圖4 CAI對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD3+ T細(xì)胞和CD8+CD3+T細(xì)胞所占比例的影響

綜上所述，本研究初步證實(shí)CAI能夠抑制MC38和C26細(xì)胞的存活、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可能通過上調(diào)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD3+T細(xì)胞和CD8+CD3+T細(xì)胞的比例增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抑制MC38和C26細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這為進(jìn)一步探索CAI在免疫治療中的作用，探究更加有效的結(jié)腸癌治療方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)本研究也存在一定的局限性。腫瘤微環(huán)境極其復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞類型，如炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些基質(zhì)細(xì)胞通過釋放各種分子重塑周圍區(qū)域，在腫瘤的生長過程中起到重要作用[11]。因而單純在體外將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)可能無法有效模擬體內(nèi)真實(shí)的腫瘤微環(huán)境。未來，本課題組將會通過在體實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探索CAI對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。