馬嘉燁，徐進川，晏博，盧水華

復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心結核病研究中心，上海 201508

結核病由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年的全球結核病報告，2019年在全球范圍內約有710萬結核病新發(fā)病例，發(fā)病率為130/10萬[1]。在單一傳染病中，結核病導致的死亡人數(shù)最高，仍然是世界上最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。我國作為結核病高負擔國家，新發(fā)病例數(shù)為83.3萬，位居全球第二，發(fā)病率為58/10萬[1]。除了活動性結核病，全球還有大量的結核潛伏感染者。結核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)是機體對結核分枝桿菌抗原持續(xù)性免疫反應的狀態(tài)，無活動性結核病臨床癥狀，也無結核病影像學表現(xiàn)[2]。2014年，全球約有17億人為LTBI，占全球人口總數(shù)的23%[3]。2015年中國第一項大規(guī)模多中心LTBI的前瞻性隊列研究在4個農村研究點進行，共 21 022 人，結果顯示結核潛伏感染者約占13%～20%[4-5]。結核潛伏感染者一生中進展為活動性結核病的概率約為5%～10%[2]，是活動性結核病的重要來源。一項系統(tǒng)綜述顯示，約11%結核抗原免疫反應陽性的LTBI人群在免疫抑制時可進展為結核病，且主要集中在感染后兩年內發(fā)病[6]。2015年美國通過國家結核病監(jiān)測和基因分型數(shù)據(jù)估算近期傳播的結核病病例比例，研究表明超過85%的結核病病例源自LTBI的再激活[7]。因此，準確診斷LTBI人群，確定有效的干預方案，可以極大地降低結核發(fā)病率和治療成本，而一個簡單易行的標準化LTBI模型對于上述問題的解決將十分重要。鑒于此，本文對近年來LTBI動物模型的研究進展進行綜述，期望對結核病防治有所裨益。

1 LTBI動物模型研究現(xiàn)狀及定義

LTBI是否進展為活動性結核病取決于細菌和宿主免疫系統(tǒng)復雜的相互作用。在大多數(shù)情況下，宿主免疫力低下時LTBI狀態(tài)容易被激活成活動性結核病。目前，對于人感染M.tb后進入潛伏期的機制和再激活的原因仍不清楚，主要因為一方面目前對于LTBI的臨床診斷還缺乏金標準[1]，另一方面缺乏簡單易行的標準化LTBI動物模型[8-9]。已有報道的LTBI動物模型主要分為2類：一類為自然潛伏感染；另一類為干預(抗結核藥物或疫苗等)誘導的潛伏感染[10-13]。目前，最常用的動物感染模型為小鼠模型，而豚鼠、兔子和非人靈長類等哺乳動物以及斑馬魚等非哺乳類動物，因各自的優(yōu)勢特點也有頗多研究報道[14-17]。以小鼠模型為例，目前文獻中對LTBI動物模型普遍定義為：肺、脾中菌持續(xù)存在，但荷菌量穩(wěn)定；長期無活動性結核病的臨床癥狀(小鼠表現(xiàn)為體重減輕，活躍度降低，出現(xiàn)過度的舔舐、抓撓行為及異常的呻吟，開始出現(xiàn)駝背，呼吸淺快，眼、鼻具有分泌物等癥狀)；長時間內無自發(fā)性復發(fā)；糖皮質激素等免疫抑制劑可重新激活細菌，轉為活動性結核病[10]。

圖1 干預誘導LTBI動物模型框架

2 常見LTBI動物模型的建立及其應用

2.1 小鼠LTBI模型

2.1.1 自然形成潛伏感染模型20世紀60年代，Hart和Rees等[18-20]研究抗結核藥物在不同感染狀態(tài)下(急性感染和慢性感染)的殺菌能力時，提出了小鼠結核慢性感染模型，但因接種菌量高(8×106CFU)，24%的小鼠在第5周時即死于進行性發(fā)展的活動性結核病。20世紀末，Orme[21]、Phyu等[10]、Arriaga等[22]使用不同菌株(H37Rv或Erdman株等)，不同菌量，通過不同的感染途徑感染(C57BL/6×DBA/2)小鼠，對構建LTBI小鼠模型的條件進行了探索(見表1)。其中Phyu等[10]提出4×104～4×105CFU H37Rv株腹腔注射感染小鼠，感染后21～52周小鼠無活動性結核病的臨床癥狀(小鼠體重減輕、活躍度降低、呼吸淺快等癥狀)，且肺、脾中能維持穩(wěn)定的荷菌量，肺臟沒有大體形態(tài)學改變及病理學改變。53周開始，每天給予口服皮質類固醇激素(初始劑量為最終劑量1.07 mg的25%，按初始劑量服用10周后逐漸加倍，13周達最終劑量)，小鼠出現(xiàn)結核急性感染癥狀，器官荷菌量上升，病理改變逐漸加重，肉眼可見灰色針尖樣結節(jié)，鏡下可見炎癥細胞聚集性肉芽腫結構，組織細胞內可見分枝桿菌抗原；而未口服皮質類固醇激素的小鼠存活了100周以上，在107周左右開始進展成活動性結核病[10]。此模型很好地模擬了自發(fā)形成潛伏感染的特點，但其潛伏期較長(可長達107 周)，對于潛伏-復發(fā)機制研究，以及利用復發(fā)情況來進行藥物和疫苗的評價來說研究周期過長。

2.1.2 干預誘導潛伏感染模型為縮短建模周期，便于研究結核潛伏感染復發(fā)機制等，眾多研究者利用抗結核藥物或疫苗等對LTBI動物模型進行了改進。

Cornell模型是最經典的小鼠干預誘導形成的LTBI模型，20世紀50年代由McCune及其同事在美國康奈爾大學提出[11, 23-25]。在Cornell模型中，M.tb感染的小鼠喂食含異煙肼(isoniazid, INH)和吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)的飼料后，組織中可呈現(xiàn)長期無菌狀態(tài)(低于檢測下限)，停用抗結核藥物一段時間后，結核桿菌可重新激活恢復培養(yǎng)陽性的狀態(tài)。在該模型中，使用1×106～3×106CFU H37Rv株靜脈注射感染雄性Swiss Webster小鼠，感染后20 min內開始用INH(每日飼料0.0125%)和PZA(每日飼料2%)治療持續(xù)12周。治療37天后，在肺和脾中均檢測不到細菌。但停藥后90天，大約1/3受檢動物的肺和脾臟中可檢測到結核桿菌。治療完成后使用大劑量可的松會使M.tb重新激活，可的松可導致50%的小鼠恢復培養(yǎng)陽性狀態(tài)的時間從7個月縮短至2.5個月。

20世紀末21世紀初，Scanga等[12]和Flynn等[26]、Botha和Ryffel[27]基于Cornell模型，在感染菌量、抗結核藥物治療持續(xù)時間、藥物劑量以及藥物停止使用至免疫干預開始的時間間隔方面做了一系列改進，提出了多種Cornell改進模型。其中，Scanga等[12]運用1×105CFU Erdman株靜脈感染小鼠，感染4周后用PZA(8 g/L)和INH(0.1 g/L)治療12周，治療后肺、脾勻漿培養(yǎng)呈陰性，之后126天均未觀察到LTBI的自發(fā)激活；而在完成抗生素治療11周后進行MP6-XT22(鼠TNF-α抗體)干預組，96天后60%小鼠肺、脾勻漿培養(yǎng)呈陽性，126天全部小鼠可見LTBI重新激活。Botha和Ryffel[27]則用30 CFU H37Rv株以氣溶膠途徑感染C57BL/6小鼠，感染后2周在飲水中添加RMP(Rifampicin, 0.1 g/L)和INH(Isoniazid, 0.1 g/L)治療8周，停止治療20周后給予2.5% (wt/vol) 氨基胍(iNOS抑制劑)，干預2周即可見到LTBI重新激活，肺中荷菌量顯著上升，而未干預組55周時仍未有自發(fā)激活現(xiàn)象，肺勻漿培養(yǎng)仍為陰性。Scanga和Botha的方法均實現(xiàn)了短時間內無自發(fā)激活現(xiàn)象但用免疫抑制劑等干預可誘發(fā)LTBI再激活的目標，達到大量活菌存留的慢性感染狀態(tài)和細菌清除的疾病治愈狀態(tài)之間的平衡。

小鼠Cornell模型及其變體具有極低數(shù)量或無法檢測到的M.tb，并可維持此狀態(tài)數(shù)周(見表1)，其已被廣泛用于抗結核藥物治療方案的有效性評估[28-31]、疫苗評價[32]，以及LTBI的免疫學、病原學研究和潛伏感染機制及潛伏-復發(fā)機制的研究。但有研究認為， Cornell模型的潛伏期是人為誘導，且在感染后20 min內即開始抗結核治療，干擾了宿主對感染的自然免疫反應，未關注宿主免疫在維持潛伏感染中的作用，早期免疫機制無法研究。長期抗結核藥物治療可引起M.tb表型發(fā)生改變，形態(tài)、生長和抗酸染色上具有差異，如在研究Cornell模型變體時發(fā)現(xiàn)抗結核藥物治療后運用免疫抑制劑重新激活的結核分枝桿菌在培養(yǎng)基上呈非典型小而光滑的菌落，抗酸染色陰性且無法在7H9中傳代培養(yǎng)，但PCR擴增證明其為結核分枝桿菌[12]。

因此，除了運用抗結核藥物，美國約翰霍普金斯結核研究中心Nuermberger等[13]提出，運用BCG等疫苗提前免疫小鼠，增強自身免疫控制M.tb感染，使小鼠最終處于潛伏感染狀態(tài)(<104CFU/肺)。其用BCG通過氣溶膠(2.3×108CFU/mL)和靜脈途徑(5×105CFU/mL)提前免疫雌性BALB/c小鼠，免疫6周后，氣溶膠途徑感染500 CFU H37Rv株，感染后第6周，未免疫組小鼠肺中菌落計數(shù)比BCG提前免疫組(靜脈/氣溶膠途徑)小鼠高20～200倍，提前免疫組脾中未檢出菌，未免疫組脾中菌量仍高達2.75×104CFU，且未免疫組小鼠肺部病理損傷及肉芽腫改變均比提前免疫組嚴重。因此，BCG氣溶膠途徑提前免疫小鼠可使小鼠更能抵抗之后的M.tb攻擊。之后，Nuermberger等[33]運用此模型有效評估了多種LTBI治療方案，得出3HP(利福噴汀聯(lián)合異煙肼，3個月，每周1次)與6H和9H(異煙肼，6/9個月，每日1次)療效相當，為制定改進LTBI治療方案提供了一定的參考。隨后， Nuermberger團隊[34]進一步改進了此模型，運用免疫原性更強的rBCG30和ticeBCG提前免疫小鼠，使小鼠菌量穩(wěn)定保持在104CFU以下。C3HeB/FeJ小鼠的研究，表明其能發(fā)展出干酪樣壞死和缺氧性病變[35]，又在上述模型基礎上將BALB/c小鼠改進為C3HeB/FeJ小鼠，建立了可以發(fā)展成干酪樣壞死性肉芽腫的LTBI小鼠模型，并有效驗證了多種新型抗結核藥物及聯(lián)合治療方案的有效性，且證明了C3HeB/FeJ小鼠中療效與BALB/c小鼠相當[36]。

2.2 其他哺乳動物LTBI模型

2.2.1 豚鼠LTBI模型常見的幾種小鼠品系在感染M.tb后肺部不能出現(xiàn)典型的肉芽腫結構，因此曾被認為不適合作為研究肉芽腫相關的動物模型。而豚鼠結核感染模型能夠形成與結核病人非常相似的中央干酪樣壞死性肉芽腫，因此成為研究肺結核肺部組織病理學的熱門選擇[37]，也有較多研究者利用豚鼠構建LTBI模型。但豚鼠對M.tb的劑量高度敏感，無論是通過靜脈還是氣溶膠低劑量感染，都易進展成活動性結核病導致體重減輕甚至死亡。為了解決這個問題，Kashino等[14]用鏈霉素營養(yǎng)缺陷型M.tb菌株18b構建豚鼠潛伏感染模型，此模型豚鼠肺、脾部的菌量降至100 CFU以下，未出現(xiàn)活動性結核病的臨床癥狀，但本實驗中未明確證明此豚鼠潛伏感染模型能否重新激活。國內也有構建豚鼠LTBI模型的研究，黎友倫等[38]運用500 CFU H37Rv株通過腹股溝皮下注射感染雌性健康豚鼠，感染2周后用10 mg/kg異煙肼和40 mg/kg吡嗪酰胺灌胃，每周3次，分別治療4、8和12周停藥，停藥后繼續(xù)飼養(yǎng)。8周和12周較長時間的治療可顯著抑制M.tb在豚鼠體內增殖，肺、脾中菌不可檢出，長時間停藥或經糖皮質激素誘導，可導致部分豚鼠的結核病自然復發(fā)或誘導復發(fā)。豚鼠在疫苗質量控制、有效性和安全性評估中也具有重要的應用價值。盧錦標等[39]用5×103CFUM.tb(CMCC95052)經腹股溝皮下注射感染Hartley豚鼠構建潛伏感染狀態(tài)，并通過此模型驗證了AEC/BC02和AEC/BC03兩種疫苗在控制臟器菌量和減輕臟器病理改變中的作用[40]。

2.2.2 兔LTBI模型兔在結核分枝桿菌感染后也會形成與結核病人結構相似的肉芽腫結構。并且兔的結核感染模型能夠展現(xiàn)出人類感染結核后的多種階段，如：活動性結核病、自發(fā)形成LTBI或隨著時間推移細菌清除，疾病消退[41-42]。21世紀初，Manabe等[15]、Subbian等[42]運用H37Rv株或臨床分離的M.tb CDC1551株等以氣溶膠途徑感染雌性新西蘭白兔構建兔LTBI模型，兩者兔肺中均未檢測到M.tb，無自發(fā)激活現(xiàn)象，而運用糖皮質激素類藥物干預則能激活潛伏感染狀態(tài)。

2.2.3非人靈長類LTBI模型 非人靈長類具有與人類相似的結核肉芽腫結構，可模擬人類結核病自然潛伏感染的過程，重現(xiàn)人類LTBI的臨床特征[43]，是人類結核病重要的研究模型。21世紀初，Capuano等[16]將約25 CFUM.tbErdman株通過支氣管鏡滴入成年食蟹猴肺中，觀察到其中50%～60%的猴子出現(xiàn)慢性活動性感染，最后進展為晚期結核病，約40%的猴子沒有發(fā)病，呈現(xiàn)出人類LTBI的特點。2010年，該團隊又在上述食蟹猴模型的基礎上驗證了腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)抑制劑會影響肉芽腫結構，導致活動性結核病進展，出現(xiàn)爆發(fā)性和播散性結核，也能重新激活LTBI[44]。和兔模型一樣，非人靈長類肺結核模型中不同猴子品種感染不同的M.tb菌株(Erdman株和H37Rv株)，通過不同的感染途徑，均可導致不同的臨床結局[45]。如上述食蟹猴低劑量感染模型表現(xiàn)出人類M.tb感染的全貌，展現(xiàn)了不同的臨床結局和組織病理變化。臨床結局包括迅速進展的結核病、慢性活動性結核感染和LTBI，組織病理包括干酪性肉芽腫、固體細胞性肉芽腫和纖維鈣化性肉芽腫[16]。這些優(yōu)點結合先進的成像技術和基因編碼技術使非人靈長類動物模型成為研究M.tb感染發(fā)病機制、宿主與結核分枝桿菌相互作用、活動性結核和LTBI的免疫學變化及肉芽腫組織病理的優(yōu)勢模型[46-47]，并在評估新型候選抗結核藥物、新型疫苗臨床前有效性及安全性，制定和改進抗結核聯(lián)合治療方案，評估抗菌藥物在預防LTBI再激活的功效中發(fā)揮重要作用[48-49]。同時，目前有較多研究使用非人類靈長類LTBI模型研究結核分枝桿菌-人類免疫缺陷病毒(TB-HIV)共感染個體中早期免疫學指標的變化和HIV誘導LTBI重新激活的機制，預測再激活風險的生物學指標，為TB-HIV共感染人群預測再激活風險并及時進行抗結核治療提供了重要的依據(jù)[50-53]。但是，非人靈長類動物M.tb感染模型飼養(yǎng)成本和感染后維護成本非常高，需要使用的大動物P3實驗室硬件要求高，較難大規(guī)模推廣使用。

2.3 非哺乳動物LTBI模型

2.3.1 斑馬魚LTBI模型除上述哺乳動物外，斑馬魚因其遺傳學操作便利，且無須使用高等級生物安全實驗室的優(yōu)勢，開始逐步運用到宿主與分枝桿菌相互作用的研究。斑馬魚是海分枝桿菌的天然宿主，其感染海分枝桿菌后可形成與人類相似的肉芽腫結構并形成干酪樣壞死。斑馬魚LTBI模型的建立最早被Parikka的研究小組報道，Parikka等[17]使用約35 CFU低劑量海分枝桿菌(ATCC 927)腹腔注射感染成年野生型AB斑馬魚，感染4周后形成潛伏感染狀態(tài)，荷菌量、肉芽腫數(shù)量穩(wěn)定。感染后5個月，給予2次γ射線(25Gy)照射后，斑馬魚陸續(xù)死亡，終點死亡率為88%。2018年，該研究小組在上述LTBI模型的基礎上改用地塞米松進行免疫抑制，地塞米松也可重新激活LTBI狀態(tài)，器官內菌量開始增加，肉芽腫數(shù)目增多，結構變大、變松，分枝桿菌逸散到組織中[54]。雖然斑馬魚作為LTBI模型的研究目前還比較少，且其免疫學研究相關的抗體等資源商品化產品還不夠完善，需要研究者自行開發(fā)定制。但斑馬魚LTBI模型的建立成本相對較低，培養(yǎng)周期快，斑馬魚的免疫系統(tǒng)和人相比高度保守，易于進行基因操作，在胚胎及幼蟲前期保持透明，可在熒光標記下實時觀察細菌和免疫細胞的相互作用，使得該模型在研究宿主-分枝桿菌的相互作用、分枝桿菌潛伏-復發(fā)感染的機制等方面具有一定的優(yōu)勢。

3 LTBI模型評估指標

在小鼠LTBI模型中，大多依據(jù)器官勻漿CFU菌落計數(shù)、器官大體形態(tài)學改變、組織病理學改變(Ziehl-Neelsen抗酸染色：直接觀察組織中結核分枝桿菌載量；HE染色：觀察組織器官中肉芽腫數(shù)目及結構變化；免疫組織化學：檢測結核分枝桿菌抗原或相關細胞因子)來判定小鼠是否處于潛伏感染狀態(tài)[10-13]，部分研究額外進行肺組織結核分枝桿菌DNA原位PCR檢測，或檢測結核感染相關細胞因子包括IFN-γ(干擾素)、TNF-α、iNOS、IL-1(白細胞介素)等的表達情況[22]。文獻中小鼠LTBI狀態(tài)判定標準一般為小鼠肺、脾(和肝)中檢測不到活菌(低于檢測下限)或CFU計數(shù)保持穩(wěn)定不增長的狀態(tài)，肺、脾(和肝)中未見炎癥浸潤及肉芽腫病理改變或只見細小肉芽腫但長時間內無數(shù)量及結構的變化。但Phyu等[10]的研究表明，疾病臨床癥狀嚴重程度和器官勻漿CFU計數(shù)無規(guī)律的相關性，而和組織病理學改變的嚴重程度相關，且從器官勻漿中得到的結核分枝桿菌培養(yǎng)時間較長(2個月以上)，表明其從休眠期恢復存在較長的遲滯期。因此，判斷小鼠處于LTBI狀態(tài)須合并小鼠的一般狀態(tài)(體重、毛發(fā)、呼吸等)、器官菌落計數(shù)、器官組織病理學表現(xiàn)或脾臟和肝臟重量、大小變化等因素來綜合評估。

而在非人靈長類LTBI模型中，由于其與人類在親緣關系上最為接近，可展現(xiàn)類似人感染M.tb后的多種臨床結局，如活動性結核病和LTBI等，可結合臨床指標及多種無創(chuàng)影像學檢查來判斷非人靈長類是否處于LTBI狀態(tài)。文獻中多定義為感染后無活動性結核病臨床癥狀(如體重減輕、咳嗽等)，無結核病影像學表現(xiàn)，無病原學證據(jù)(如：支氣管肺泡灌洗液或胃抽吸物等M.tb培養(yǎng)陰性)及炎癥指標正常(紅細胞沉降率正常)等[55]。

4 LTBI模型驗證

在確定已建立的小鼠模型是否為LTBI狀態(tài)時，常將已建立的小鼠LTBI模型分為2組：一組運用已被廣泛認可與結核感染相關的免疫抑制劑(地塞米松、可的松、氨基胍(iNOS抑制劑)、TNF-α抑制劑等)；一組則不予干預。驗證小鼠LTBI狀態(tài)在免疫抑制的情況下是否可被激活及短時間內是否有大量的自發(fā)激活現(xiàn)象，若感染菌量過少，藥物治療時間過長等導致細菌已被完全清除，免疫抑制狀態(tài)下也無法誘導激活；或短時間內即有較多小鼠出現(xiàn)自發(fā)激活，進入結核急性感染狀態(tài)，則說明該模型并非處于LTBI狀態(tài)[10,12,27]。

驗證非人靈長類LTBI模型，最終尸檢時肺部病理進一步支持上述臨床評估指標分類方案的有效性，LTBI的非人靈長類模型中病變范圍更局限，甚至無肉眼可見的肺部病變，只有淋巴結受累。肺葉及淋巴結中的細菌負荷量比活動性結核病者更低[55]。

5 目前存在的挑戰(zhàn)

哺乳動物的LTBI模型普遍面臨實驗周期長、費用昂貴、需要使用動物高等級生物安全實驗室等諸多問題。此外，主要通過離體檢測組織器官中菌落數(shù)量、病理改變(如肉芽腫數(shù)目、大小、結構改變等)、炎癥因子和細胞因子的改變等區(qū)分活動性結核病及LTBI狀態(tài)。該檢測需要在幾個不同的時間點處死動物，分離器官，需要大量的實驗動物。每個時間點處死不同的動物，無法評估同一動物疾病狀態(tài)的變化，且結核分枝桿菌生長緩慢，常在4周后才能獲得結果，使得相關研究周期較長。另外，動物高等級生物安全實驗室對于硬件設施和實驗操作人員的專業(yè)性要求均較高，而且LTBI模型相關研究周期長，國內很少有團隊具備硬件條件和資金開展系統(tǒng)性的研究工作。

然而，科技的進步和多學科的交融也促進了LTBI模型相關的研究。越來越多的先進技術如無創(chuàng)的磁共振成像(MRI)、18氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)正電子發(fā)射計算機斷層掃描(PET/CT)[56-57]和靶向巨噬細胞的放射性碘標記DPA-713(125I-DPA-713)單光子發(fā)射計算機斷層掃描成像(SPECT/CT)等[58]，被用于監(jiān)測結核病的病程發(fā)展。這些無創(chuàng)、非侵入性的操作，所需動物更少，極大地促進了對于費用昂貴的非人靈長類LTBI模型的研究。無創(chuàng)操作還可在不同時間點連續(xù)評估同一動物的疾病狀態(tài)變化，減少個體差異帶來的誤差。感染劑量的差異及非人靈長類動物個體間的差異，導致傳統(tǒng)的檢測手段很難確定每個動物個體的復發(fā)的時間，而成像技術的發(fā)展和運用則為解決此類問題提供了很好的思路。

6 結語

目前，因宿主易感性的差異，老年人、兒童、免疫缺陷患者[原發(fā)性免疫缺陷和繼發(fā)性免疫缺陷(HIV感染者)]等感染M.tb的表現(xiàn)有諸多差異。因此，全面認識M.tb感染，判斷M.tb感染后所處的疾病狀態(tài)，了解結核再復發(fā)的機制，開發(fā)新的抗結核藥物及疫苗迫在眉睫，而標準化的動物模型、快速準確的評價方式在研究中具有關鍵作用。