李飛，朱其國(guó)，施鵬，曹凌峰，王立波，陸柔劍，譚文杰，沈軍

1. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院感染傳染科，上海 201102； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院廈門(mén)分院呼吸科，福建 廈門(mén) 361006； 3. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)管理中心，上海 201102； 4. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室，上海 201102； 5. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院呼吸科，上海 201102； 6. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心，北京 102206

肺炎是兒童住院治療的常見(jiàn)原因，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)曾是導(dǎo)致兒童大葉性肺炎的主要病原體。疫苗的接種和抗菌素的普遍使用，可能導(dǎo)致SP的兒童實(shí)變性肺炎的主要病原體[1-3]。由于肺炎發(fā)生時(shí)存在于肺部的病原體尚不能明確，因而研究病原譜構(gòu)成對(duì)臨床上制訂抗感染治療策略、對(duì)疾病進(jìn)行防控等有直接指導(dǎo)意義。對(duì)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，能較準(zhǔn)確反映肺部病原體的感染情況，但一般只在較嚴(yán)重的肺部感染如肺部實(shí)變不張時(shí)通過(guò)支氣管鏡診治時(shí)采集[4-6]。對(duì)存在肺炎肺實(shí)變患兒的BALF標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)與分析，可以了解此類臨床表型患兒的肺部病原體構(gòu)成。本研究依托國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心病原學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，分析2019年1月—2020年1月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院纖維支氣管鏡室診治的住院肺炎病例的BALF標(biāo)本病原譜，期望供臨床和科研參考，并為今后多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiple polymerase chain reaction，multiple PCR)、二代測(cè)序(也稱next-generation sequencing，NGS)等新技術(shù)平臺(tái)在臨床應(yīng)用[6-7]提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

以2019年1月—2020年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心)纖維支氣管鏡室接受診治的291例患兒及其293份BALF標(biāo)本為研究對(duì)象。納入標(biāo)椎為研究期間本中心所有行纖維支氣管鏡檢查的病例及對(duì)應(yīng)獲取的BALF標(biāo)本；排除標(biāo)準(zhǔn)為院內(nèi)呼吸道感染、新生兒、氣道異物吸入、肺結(jié)核等病例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。病例診斷參照兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范(2019年版)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本信息采集根據(jù)統(tǒng)一的流行病學(xué)調(diào)查表，由專人采集醫(yī)院360電子信息系統(tǒng)中樣本人群的臨床信息，包括影像學(xué)檢查和病原學(xué)資料。臨床信息包括患者的年齡、性別、臨床診斷和纖維支氣管鏡手術(shù)日期，影像學(xué)檢查包括胸部X線檢查、胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)。

病原學(xué)資料由兩名高年資小兒感染科醫(yī)師基于臨床信息解讀。

1.2.2 檢測(cè)試劑盒將BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培 養(yǎng)，同時(shí)采用直接免疫熒光法(direct immunofluorescence assay，DFA)檢測(cè)標(biāo)本中呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型/乙型流感病毒、副流感病毒1型/2型/3型、人偏肺病毒8種呼吸道病毒。使用美國(guó)Chemicon公司的呼吸道病毒診斷試劑盒檢測(cè)呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感與乙型流感病毒、副流感病毒1型/2型/3型；人偏肺病毒檢測(cè)采用美國(guó)HYBRIDS公司Metapneumovirus DFA Reagent試劑盒完成。BALF鼻病毒檢測(cè)采用湖北朗德醫(yī)療科技有限公司人鼻病毒核酸檢測(cè)PCR-熒光探針?lè)ㄔ噭┖型瓿?；BALF肺炎支原體檢測(cè)使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒完成。上述檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-cell spot test for tuberculosis infection, T-SPOT)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)報(bào)道[8]進(jìn)行。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗術(shù)患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)，局麻下進(jìn)行手術(shù)。選擇患兒病變肺段，將支氣管鏡置于目的肺葉，使用生理鹽水分3次進(jìn)行灌洗，總量1～3 mL/kg；吸引器以25～100 kPa負(fù)壓收集BALF于無(wú)菌試管，4～8 ℃條件下送中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，若不能及時(shí)送檢則置于 -80 ℃凍存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床信息

291例患兒中5例患兒存在氣道異物或吸入，共286例患兒納入研究；每名患兒可采集到1份獨(dú)立標(biāo)本，共286份。其中，195例患兒存在肺炎肺實(shí)變，對(duì)應(yīng)195份BALF標(biāo)本(見(jiàn)表1)。

表1 286例患兒信息特征

由患兒信息特征數(shù)據(jù)可知， 12.2%(35/286)的患兒存在基礎(chǔ)疾病，分別為免疫缺陷7例(低丙種球蛋白血癥1例、無(wú)丙種球蛋白血癥1例、慢性肉芽腫病1例、PIK3CD基因突變2例、SH2D1A基因突變1例、CD48LG基因突變1例)，支氣管哮喘6例，支氣管狹窄2例，囊性纖維化病伴支氣管擴(kuò)張和胰腺外分泌功能不全1例，癲癇1例，結(jié)節(jié)性硬化癥1例，先天性支氣管軟化伴漏斗胸1例，Prader-Willi綜合征1例，先天性支氣管狹窄伴肌性斜頸1例，先天性單腎缺如1例、先天性心臟病(術(shù)后)1例，染色體異常伴腦發(fā)育不全1例，喉先天性畸形(喉裂術(shù)后)1例，胃食管反流1例，系統(tǒng)性血管炎(ANCA相關(guān)性血管炎)1例，食管裂孔疝1例，色素失調(diào)癥伴左側(cè)視網(wǎng)膜摘除術(shù)后1例，先天性外耳道閉鎖(左側(cè))1例，先天性半椎體畸形(左側(cè)T3)伴先天性心臟病(繼發(fā)房缺、卵圓孔未閉)1例，髓質(zhì)海綿腎1例，幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎1例，幼年型皮肌炎1例，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩伴房室分離1例。

2.2 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 病原檢出情況286份標(biāo)本中病原總檢出率為76.6%(219/286)；肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變肺炎患兒標(biāo)本病原檢出率分別為77.9%(152/195)和73.6%(67/91)。286份標(biāo)本中，單種病原檢出率為61.9%(177/286)，其中肺炎支原體單獨(dú)檢出率為52.1%(149/286)，混合病原檢出率為14.7%(42/286)。前5種檢出病原體為肺炎支原體、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型，檢出率分別為65.4%(187/286)、9.8%(28/286)、6.6%(19/286)、2.4%(7/286)和2.4%(7/286)；肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變肺炎患兒標(biāo)本中前5種病原相同，且檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體如表2所示。

表2 286例患兒病原體檢出分布

286份標(biāo)本中細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽(yáng)性11份(株)：其中肺炎鏈球菌5株(4株單一感染，1株合并肺炎支原體陽(yáng)性)、銅綠假單胞菌2株(1株合并肺炎支原體陽(yáng)性，1株合并肺炎支原體和鼻病毒陽(yáng)性)、金黃色葡萄球菌(合并肺炎支原體和鼻病毒陽(yáng)性)、副流感嗜血桿菌(單一感染)、鮑曼不動(dòng)桿菌(合并肺炎支原體陽(yáng)性)和嗜麥芽假單胞菌(合并肺炎支原體、鼻病毒和副流感病毒3型陽(yáng)性)各1株。所有標(biāo)本真菌培養(yǎng)陰性，且所有病例T-SPOT結(jié)果陰性。

肺炎支原體real-time PCR檢測(cè)陽(yáng)性判定為肺炎支原體陽(yáng)性，本研究肺炎支原體陽(yáng)性檢出率為65.4%(187/286)。

2.2.2 各月份病原體檢出情況肺炎支原體呈全年高檢出表現(xiàn)，在8月份檢出率最高，為92.3%(12/13)；腺病毒檢出率也在8月份達(dá)最高，為23.1%(3/13)；鼻病毒檢出率在10月份最高，為15.0%(3/20)。各病原不同月份檢出分布流向如圖1所示。

Note：drawned by Power BI software, the widths of the data bars on both sides correspond to the monthly specimen numbers and the positive specimen samples of each pathogen.

2.2.3 各年齡組病原檢出率比較3個(gè)年齡組總病原檢出率差異比較：<1歲、1～<5歲、≥5歲患兒中總病原檢出率分別為 68.8%(11/16)、70.5%(74/105)和81.2%(134/165)，各兩組間病原檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肺炎支原體在各年齡組中的檢出率分別為31.3%(5/16)、53.3%(56/105)和77.0%(127/165)，各兩組間肺炎支原體檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且年齡越大，檢出率越高；腺病毒、鼻病毒的檢出率則隨年齡增長(zhǎng)而下降。具體如圖2所示。

注：A總病原；B肺炎支原體；C腺病毒；D鼻病毒；E呼吸道合胞病毒；F副流感病毒3型；*P<0.05。

2.2.4 各年齡組肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變病例病原檢出率比較各年齡組內(nèi)有、無(wú)肺實(shí)變總病原檢出率差異比較：<1歲、1～<5歲、≥5歲患兒中有肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變病例總病原檢出率分別為66.7%(8/12)和75.0%(3/4)、71.7%(43/60)和68.9%(31/45)、82.1%(101/123)和78.6%(33/42)，檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各年齡組內(nèi)有、無(wú)肺實(shí)變患兒之間幾種主要病原檢出率差異比較：各年齡組患兒無(wú)論是否有肺實(shí)變，其肺炎支原體、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型的檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1～<5歲有肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變病例中腺病毒檢出率分別為26.7%(16/60)和68.9%(31/45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，<1歲和≥5歲病例中，有肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變患兒的腺病毒檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體如圖3所示。

注：A總病原；B肺炎支原體；C腺病毒；D鼻病毒；E呼吸道合胞病毒；F副流感病毒3型。

3 討論

兒科臨床中肺炎肺實(shí)變的病例較常見(jiàn)，但典型的肺炎球菌性肺炎(又稱大葉性肺炎)發(fā)病率已降低[1,9]。感染性肺炎伴肺實(shí)變相對(duì)于無(wú)實(shí)變病例，其抗感染治療可能相對(duì)復(fù)雜，并易形成肺空洞、壞死性肺炎等遠(yuǎn)期并發(fā)癥。對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)基本可確定導(dǎo)致肺部炎癥的真實(shí)病原體[3,5,7]，明確肺部病原體對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療有指導(dǎo)作用。本研究基于國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心較成熟的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)和感染?？频挠欣麠l件，對(duì)2019年1月—2020年1月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心)的單中心纖維支氣管鏡手術(shù)病例的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。在納入的286例病例中，最小年齡為0.4歲，最大年齡為17歲，平均年齡和中位數(shù)分別為5.7歲和6.0歲， 提示研究樣本人群亦是期間實(shí)施纖維支氣管鏡手術(shù)的主要人群，即5歲左右的學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童。課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，上海社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)患兒中，≥5歲患兒由于肺炎支原體感染而導(dǎo)致急性下呼吸道感染的可能性明顯升高，同時(shí)腺病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒亦均為本地區(qū)兒童急性下呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體[10-15]。<1歲及≥5歲患兒的CAP病原譜與 1～<5 歲患兒相比可能存在差異[1,2,10-11, 15]，因此本研究按此年齡分層進(jìn)行分析。肺炎伴肺實(shí)變患兒與無(wú)肺實(shí)變患兒的致病原之間是否存在明顯差異是本研究的目的之一。

在本研究中，總病原檢出率為76.6%(219/286)，明顯高于課題組以往研究的急性下呼吸道感染住院患兒標(biāo)本53.9%的總病原檢出率[10]。可能的原因是，一方面本研究檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液而非經(jīng)鼻吸取的深部痰液，可能有更高的病原檢出率；另一方面本研究中增加了鼻病毒及人偏肺病毒的檢測(cè)，兩者檢出陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)分別為19份和4份，共7份標(biāo)本是人偏肺病毒及鼻病毒單獨(dú)檢測(cè)，貢獻(xiàn)了2.4%(7/286)的檢出率(結(jié)果未顯示)；而更主要的原因可能是，本研究病例的肺部感染相對(duì)較重、存在基礎(chǔ)性疾病的患兒較多、需要纖維支氣管鏡進(jìn)行診治。前5種檢出病原為肺炎支原體、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型，檢出率分別為65.4%(187/286)、9.8%(28/286)、6.6%(19/286)、2.4%(7/286)和2.4%(7/286)，與以往兒童CAP的主要病原學(xué)研究結(jié)果基本一致[1,10,15]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在不同的兒童年齡組、不同的地理區(qū)域、不同的年份或納入的不同樣本人群中，檢測(cè)到的CAP病原譜可能不同[1,7]。

本研究的BALF細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明，肺炎鏈球菌檢出率最高，但陽(yáng)性率僅為1.7%(5/286)；細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)活菌的檢出率低，不排除與纖維支氣管鏡手術(shù)前采用抗菌素治療有關(guān)。提示今后應(yīng)采用其他技術(shù)方法，如multiplex PCR、NGS等進(jìn)一步檢測(cè)病原體核酸加以驗(yàn)證，這也是課題組未來(lái)的研究方向。

由于本研究?jī)H跨度13個(gè)月，對(duì)各病原體的季節(jié)性分布情況研究意義有限。但比較明確的是，肺炎支原體檢出率在全年均較高，包括在肺實(shí)變患兒中亦是如此；其他病原因樣本量較小，很難在病原檢出分布流行圖上體現(xiàn)其流行季節(jié)分布的特點(diǎn)，比如呼吸道合胞病毒共檢出7份標(biāo)本陽(yáng)性，其中2019年2月、3月、9月、11月和2020年1月分別有1份陽(yáng)性，2019年12月2份陽(yáng)性，這可能與以往存在冬季流行高峰[1,10,15-16]的研究結(jié)果一致。

本研究主要發(fā)現(xiàn)：①肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變肺炎患兒總病原檢出率分別為77.9%(152/195)和73.6%(67/91)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②在<1歲、1～<5歲、≥5歲3個(gè)年齡組內(nèi)，肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變肺炎患兒總病原檢出率分別為66.7%(8/12)和75.0%(3/4)，71.7%(43/60)和68.9%(31/45)，82.1%(101/123)和78.6%(33/42)，檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；③在同一年齡組內(nèi)，肺實(shí)變和無(wú)肺實(shí)變的肺炎病例中，肺炎支原體、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型的檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，1～<5歲有肺實(shí)變和無(wú)實(shí)變病例中腺病毒檢出率分別為26.7%(16/60)和68.9%(31/45)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在<1歲和≥5歲病例中，有肺實(shí)變和無(wú)實(shí)變患兒的腺病毒檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果提示，導(dǎo)致肺實(shí)變CAP的主要病原體與無(wú)肺實(shí)變CAP的主要病原體可能基本相同，這對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療有一定的參考意義。

在本研究中，<1歲、1～<5歲、≥5歲3個(gè)年齡組病例的總病原檢出率分別為68.8%(11/16)、70.5%(74/105)和81.2%(134/165)，各兩組間病原檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示總病原檢出率可能與年齡不相關(guān)；肺炎支原體在各年齡組的檢出率分別為31.3%(5/16)、53.3%(56/105)和77.0%(127/165)，各兩組間肺炎支原體檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且年齡越大，檢出率越高；腺病毒、鼻病毒則隨年齡增長(zhǎng)，檢出率下降，證實(shí)在不同的年齡組內(nèi)，CAP病原譜可能不同，這與既往的相關(guān)研究相符[13,15]。需要指出的是，本研究中按照此年齡分層得到的所有結(jié)果，如擴(kuò)大樣本量或采用不同方法進(jìn)行年齡分層，可能會(huì)有不同的結(jié)果，后續(xù)的研究須進(jìn)一步明確。

本研究的特點(diǎn)是利用BALF對(duì)導(dǎo)致兒童CAP并肺實(shí)變的病原譜進(jìn)行分析，這對(duì)臨床有一定的提示意義。但由于單中心、小樣本量而未能將病例根據(jù)標(biāo)本采集時(shí)的病程或抗感染情況進(jìn)行分組，且病原學(xué)檢測(cè)方法不統(tǒng)一(綜合了DFA、PCR和細(xì)菌培養(yǎng))，針對(duì)以上研究局限，未來(lái)將補(bǔ)充相關(guān)的研究。今后，將針對(duì)兒童肺實(shí)變這類特殊的樣本人群，于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型等特殊病原體流行期間，開(kāi)展兒童CAP的病原學(xué)研究，利用新的技術(shù)推廣[17-19]進(jìn)一步完善兒童肺炎病原譜，理論上均可為臨床預(yù)防和診治CAP帶來(lái) 益處。