王玉櫟，劉暢，牛辰，吳健，2，3

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系, 上海 200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院上海市肝病研究所, 上海 200032

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類包含非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相關(guān)肝硬化等臨床病理癥候群。NAFLD是在排除長期大量飲酒和其他肝損因素所引起，以甘油三酯等在肝細(xì)胞中蓄積為病理改變的代謝性疾病。NAFLD病因多樣，可能同時受到脂毒性、氧化應(yīng)激、炎癥、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、表觀遺傳修飾等多種因素影響[1]。流行病學(xué)資料顯示，NAFLD已成為最常見的肝臟疾病之一，全球患病率為25.2%[2]，亞洲患病率為27.4%[3]，而我國平均患病率為15%，有些地區(qū)高達29%[4]。對于NAFLD的發(fā)生機制，比較流行的是“多重打擊”學(xué)說[5]，在各種因素相互作用下，形成“脂質(zhì)積蓄→肝脂毒性→代謝紊亂→炎癥應(yīng)答→胰島素抵抗→代謝紊亂加重”的惡性循環(huán)。腸道菌群失調(diào)可參與對肝臟的多重打擊，在NAFLD發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。腸道與肝臟通過門靜脈相連，腸道細(xì)菌及其代謝物可以通過門靜脈進入肝臟，影響其病理生理過程。因此，腸道菌群的改變及其代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是腸肝對話的分子基礎(chǔ)或信息載體[2,6]。目前，對NAFLD發(fā)病機制的認(rèn)識仍較為有限，且尚無有效治療藥物。NAFLD的干預(yù)措施側(cè)重于飲食和生活方式的改變，但由于患者依從性差，治療效果不滿意。在NAFLD的發(fā)展過程中，NASH進一步發(fā)展成肝纖維化以及肝硬化，干預(yù)NASH也就成為治療NAFLD的突破點。目前可用于治療NASH的藥物僅限于胰島素增敏劑(如吡格列酮)和維生素E。這兩種藥物在早期Ⅱ期臨床試驗中顯示對部分人群有效[7]。隨著對NAFLD患者腸道菌群的深入研究，學(xué)者們提出了一些干預(yù)腸道菌群的治療新策略，比如補充益生菌及益生元、糞菌移植(fecal microbial transplantation，F(xiàn)MT)、腸道菌群靶向療法(microbiome-targeted therapies，MTT)等[8]。調(diào)節(jié)、改造、重建腸道菌群或能成為NASH治療中的一種個性化干預(yù)手段。因此，深入探索腸道菌群的改變是研究NAFLD發(fā)生發(fā)展機制的重要組成部分，也是挖掘新治療手段的工具。本綜述重點介紹腸道菌群異常時影響NAFLD發(fā)生發(fā)展的過程和機制，并針對這些異常探討潛在的干預(yù)措施。

1 腸道菌群與菌群失調(diào)

腸道菌群是一組生存在腸道、與宿主共生的微生物群。腸道菌群數(shù)量眾多，總量達10萬億～100萬億，以細(xì)菌為主，并包括古細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒等[9-10]。菌種的數(shù)量和類型處于動態(tài)平衡，是人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一部分。細(xì)菌豐度和組成從胃到結(jié)腸遞增，表現(xiàn)出更高的多樣性，并且受到遺傳、年齡、生活方式、藥物和飲食的影響[8]。它們與人體共生，在食物消化及營養(yǎng)吸收過程中發(fā)揮重要作用，例如可以分解復(fù)雜多糖，合成多種維生素，參與膽汁酸的腸肝循環(huán)等[11]。細(xì)菌的產(chǎn)物在機體建立自主免疫過程中也發(fā)揮重要作用。嬰兒在出生時會獲得母體糞便或會陰菌群，初乳和母乳也是活細(xì)菌的豐富來源，具有菌群重建、免疫系統(tǒng)發(fā)育、食物新陳代謝和營養(yǎng)供應(yīng)等重要的有益作用[12]。腸道菌群多樣性隨著年齡的增長而逐漸降低，老年人因衰老、體力、胃腸功能下降、營養(yǎng)失衡以及過度使用抗生素，其腸道菌群發(fā)生改變[13]。有研究表明，這種腸道菌群多樣性的變化會引起促炎代謝物如氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)的產(chǎn)生，其與衰老并發(fā)的認(rèn)知衰退、精神障礙等有關(guān)[14]。研究腸道菌群的常用方法主要有：16S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)基因測序、DNA全基因組測序、基因組學(xué)等?？捎脤崟r熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real-time qPCR)檢測目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，還可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、液相色譜法等方法研究細(xì)菌代謝產(chǎn)物及微生物的組成。分離健康成人或患者糞便微生物進行特定菌系的比較也是常用手段[7,12-13,15-16]。

菌群失調(diào)是指正常的腸道菌群數(shù)量或構(gòu)成比即內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，環(huán)境、免疫或宿主因素改變都可能導(dǎo)致菌群失調(diào)[17]。菌群失調(diào)可能會直接影響脂肪因子、促炎和抗炎細(xì)胞因子以及脂肪酸β-氧化的水平[12]。大量研究表明，腸道菌群在體重調(diào)節(jié)、能量代謝、炎癥和免疫應(yīng)答等諸多病理生理過程中發(fā)揮重要作用，提示腸道菌群可能在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1,7,18-21]。

2 腸道菌群影響非酒精性脂肪性肝病的機制

2.1 NAFLD相關(guān)的腸道菌群異常

大量研究表明，NAFLD患者會出現(xiàn)腸道菌群組成比例改變或菌群失調(diào)，有研究發(fā)現(xiàn)NAFL兒童糞便樣本中γ-變形菌(γ-Proteobacteria)和普雷沃菌(Prevotella)數(shù)量明顯較多。在NAFL組中，厚壁菌和擬桿菌的比例比健康人群低，而乳桿菌屬在健康人群中比例較高，提示菌種間的比例失調(diào)[1]。還有研究報道，NASH患者中糞便擬桿菌、大腸桿菌、瘤胃球菌增多，而有益菌群如乳桿菌、雙歧桿菌減少[22]。糞便膽汁酸(bile acid，BA)檢測可反映兩條膽汁酸代謝通路，即“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”與“?；撬岷痛闻；撬岽x”的途徑改變。參與?；撬岷透拾彼岽x的細(xì)菌埃希桿菌屬(Esherichia)、嗜膽菌屬(Bilophila)和紅細(xì)菌屬(Rhodbacter)在NASH患者糞便中明顯富集[23]。與疾病早期的患者相比，NASH進展伴中度纖維化(F≥2)患者的腸道菌群有明顯不同[18]。另有研究顯示，60%的NAFLD患者其發(fā)病與感染高產(chǎn)酒精肺炎克雷伯菌(high alcoholKlebsiellapneumoniae，HiAlc-Kpn)相關(guān)，從NASH患者糞便分離出HiAlc-Kpn菌株移植到小鼠體內(nèi)會誘發(fā)小鼠NAFLD[24]。這說明腸道菌群的改變參與NAFL、NASH發(fā)生以及其向肝硬化進展的病理過程。因研究對象及手段的差異，不同研究所發(fā)現(xiàn)的菌群比例變化結(jié)果常不一致。

菌群易位(bacterial translocation，BT)指胃腸道內(nèi)寄生菌穿過黏膜，進入通常無菌的組織或器官[18]。從器官活檢標(biāo)本、患者外周血中提取特定細(xì)菌的DNA 片段，擴增后測序，可確定有無腸道細(xì)菌易位。NAFLD起始和發(fā)展過程中，腸道黏膜屏障受損，腸道通透性增加，誘發(fā)腸道菌群易位，進而越來越多的細(xì)菌代謝產(chǎn)物、細(xì)菌成分和其他化合物等可通過門靜脈進入肝臟，引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)堆積，最終導(dǎo)致脂肪性肝損傷和肝纖維化加速[7]。有研究通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，高脂飼料(high fat diet，HFD)模型小鼠肝臟中有細(xì)菌存在；進一步使用相對分子質(zhì)量為5×105的異硫氰酸熒光素葡聚糖(fluorescein isothiocyanate dextran，F(xiàn)ITC-Dextran)進行活體探針共聚焦顯微鏡成像及小鼠血清FITC-Dextran熒光強度測定，發(fā)現(xiàn)腸道通透性明顯增加，說明腸道通透性增加會引起更多細(xì)菌及細(xì)菌代謝產(chǎn)物進入肝臟[25]。而NASH患者肝臟內(nèi)是否有細(xì)菌存在還有待證實，故認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)物影響NAFLD的作用更為明確。菌群易位也是腸道免疫狀態(tài)改變的影響因素之一[18]。促炎細(xì)胞因子，如α干擾素(interferon-α，IFN-α)、IFN-γ和白細(xì)胞介素-6(interleukin，IL-6)，已被證明可以干擾腸道屏障通透性，允許腸腔抗原通過腸道屏障[19]，菌群易位也會導(dǎo)致門脈或肝內(nèi)內(nèi)毒素水平增加，病原體相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)在門靜脈循環(huán)中積聚，從而促進肝臟炎癥和NASH的發(fā)展，形成惡性循環(huán)[22]。細(xì)菌易位增加還會產(chǎn)生過量脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)和樹突狀細(xì)胞TLR9，誘導(dǎo)炎性小體和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，進一步破壞腸道黏膜通透性和降低肝臟的胰島素敏感性，從而增加內(nèi)臟和皮下脂肪[20]。

2.2 腸道菌群異常對NAFLD發(fā)病過程的影響

2.2.1 影響膽汁酸代謝及法尼醇X受體、G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體信號通路通過干擾膽汁酸代謝，菌群異常可間接影響回腸和肝臟中的法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1，Gpbar1，又稱Takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5)發(fā)揮作用，進而引起肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥和纖維化[12]。腸道菌群異常會改變膽汁酸的組成和比例，其中次級膽汁酸如FXR拮抗劑脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)的相對含量顯著增加，而初級膽汁酸如FXR激動劑鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)的相對含量顯著降低[26]。同時腸道處于炎癥狀態(tài)，其屏障功能紊亂會降低腸道FXR的表達。FXR拮抗劑增加及FXR低表達會引起肝臟脂質(zhì)堆積和血漿甘油三酯升高，并影響極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)的清除過程[21]。膽汁酸增多還會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TGR5信號，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[27]。TGR5可激活腺苷酸環(huán)化酶-cAMP和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)-src激酶途徑，src激活引起蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活。因此，依賴PKC的TGR5激活導(dǎo)致核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活，促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)表達增加，加重了肝臟的炎癥免疫反應(yīng)[28]。

2.2.2 影響脂肪累積研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著腸道菌群失調(diào)，NAFLD和肥胖使機體從飲食中獲取能量的能力增強，增加了脂肪累積。將高脂飼料所致肥胖小鼠的糞便微生物移植給正常飼料喂養(yǎng)的普通小鼠，發(fā)現(xiàn)它們比移植正常飲食小鼠糞便微生物的小鼠獲得了更多的脂肪沉積[23]。腸道菌群構(gòu)成的變化會導(dǎo)致機體吸收更多的脂質(zhì)，促進脂肪酸的生物合成[1]。腸道菌群還可以通過短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)或膽汁酸誘導(dǎo)或抑制血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein-4，AGTPL-4)介導(dǎo)脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)活性，進而影響肝外脂肪的分解及肝內(nèi)脂肪的蓄積[21]。改變腸道菌群的構(gòu)成可以緩解NAFL向NASH發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過減少宿主腸道脂肪酸吸收從而減輕肝臟脂肪累積[29]。

2.2.3 誘發(fā)或促進胰島素抵抗普雷沃菌和尋常型桿菌(Bacillusvulgaris)在胰島素抵抗患者中檢出率增加[30]，提示腸道菌群變化與胰島素抵抗有關(guān)。研究表明細(xì)菌壁外膜上的LPS可通過TRL4作用于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，釋放多種炎癥細(xì)胞因子，從而誘發(fā)胰島素抵抗[4]。胰島素敏感度下降使血液中葡萄糖的利用率下降，β胰島細(xì)胞處于代償性高分泌狀態(tài)，導(dǎo)致高胰島素血癥。而高胰島素血癥進一步損害肝臟中的胰島信號通路，形成惡性循環(huán)[31]。胰島素抵抗會引起血糖水平紊亂、損害糖原合成，將葡萄糖作為脂肪合成的底物[30]；還可促進甘油三酯(triacylglycerol，TG)積聚，引起肝細(xì)胞損傷、炎癥及纖維化[32]，從而加重NAFLD。

2.2.4 影響膽堿代謝腸道菌群失調(diào)會改變膽堿代謝，降低宿主膽堿的生物利用度[33]。革蘭氏陰性γ蛋白細(xì)菌和產(chǎn)芽孢菌(Erysipelotrichi)的水平升高會導(dǎo)致膽堿缺乏、TMAO產(chǎn)生增加，并引起脂肪變性[8]。膽堿生物利用度的降低可導(dǎo)致機體無法合成磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)，而PC對VLDL的組裝和分泌極為重要[23]。PC缺乏會促使脂肪酸合成，從而導(dǎo)致甘油三酯增加。缺乏PC的脂滴表面活性會降低，容易形成較大脂滴，并難以被脂蛋白脂酶分解[21]?？傊?，菌群失調(diào)會影響一碳代謝，減少宿主的膽堿庫，使機體處于膽堿缺乏狀態(tài)， VLDL分泌減少，導(dǎo)致肝臟脂肪堆積[33]。這也是蛋氨酸膽堿缺乏飼料(methionine/choline-deficient diet，MCD diet)引起脂肪性肝炎的機制。

2.2.5 細(xì)菌代謝產(chǎn)物對機體的影響菌群失調(diào)或菌群組成紊亂后，許多腸道微生物成分或代謝物，如肽聚糖[7]、三甲胺[21]、次級膽汁酸[27]、短鏈脂肪酸[12]、支鏈氨基酸[27]、乙醇[22]等發(fā)生改變，進入血液循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)揮促炎、改變基因表達、代謝修飾和毒性等多重作用，并調(diào)節(jié)肝臟脂肪合成，影響NAFLD的發(fā)生和進展[27]。

高脂飲食降低了食物多樣性，纖維素攝取減少導(dǎo)致腸道來源的SCFAs分泌減少，而SCFAs是維持穩(wěn)態(tài)的重要因素[34]。SCFAs可以激活L細(xì)胞(腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的一種)表面G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCRs)GPR41和GPR43，通過多種途徑影響NAFLD的發(fā)生[12]。當(dāng)SCFAs中丁酸比例下降時，脂肪因子(adipokine)的釋放增加，碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element-binding protein, ChREBP)和膽固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白-1(cholesterol-regulatory element-binding protein-1, SREBP-1)的活性因失去丁酸的抑制作用而增強，從而促進脂肪合成及脂質(zhì)沉積[12,35]。SCFAs對抗炎、維持腸上皮屏障的完整性很重要[34]。SCFAs的減少使其難以抑制特定病原菌的繁殖，機體胰島素敏感性降低，導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，加劇了NAFLD的發(fā)展進程[36]。

研究發(fā)現(xiàn)NASH患者的腸道菌群中產(chǎn)酒精性菌，如HiAlc-Kpn、溶細(xì)胞素陽性糞腸球菌增加[37-38]。這兩類細(xì)菌的過度生長使乙醇產(chǎn)量增加，腸黏膜屏障破壞使乙醇進入血液循環(huán)中，進一步加重肝臟炎癥、活性氧(reactive oxygen species，ROS)釋放和腸道高通透性[39]。酒精在腸道代謝的副產(chǎn)品乙醛也可通過損壞細(xì)胞間緊密連接的完整性而削弱腸屏障，導(dǎo)致細(xì)菌易位和內(nèi)毒素血癥[22]。腸道通透性的增加促使更多代謝產(chǎn)物及病原微生物進入血液循環(huán)，枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞被激活，炎性細(xì)胞因子大量釋放，加重NASH及肝臟纖維化[1]。腸道菌群異常與NASH發(fā)病關(guān)系的研究已取得顯著進展，然而因NASH發(fā)病機制的多樣性，或因研究手段所限，往往缺乏直接證據(jù)證實兩者間的因果關(guān)系。圖1 總結(jié)了腸道菌群在NAFLD/NASH發(fā)生、發(fā)展中的作用。

NAFLD會導(dǎo)致腸道菌群異常。菌群失調(diào)易引起膽汁酸、脂質(zhì)、胰島素、膽堿代謝紊亂，與細(xì)菌PAMP和代謝產(chǎn)物共同作用于機體，進一步引發(fā)NASH病理生理改變。

3 治療新策略

3.1 微生物組靶向療法

微生物組靶向療法(microbiome-targeted therapies, MTT)通過使用抗生素、益生菌、益生元或FMT等手段，糾正或重建腸道菌群，達到治療腸道或其他疾病的目的[40]，是治療NAFLD的新策略。商品化的鏈球菌、乳桿菌、雙歧桿菌可以改善抗炎環(huán)境，有助于腸上皮細(xì)胞的生長和存活，并可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和宿主防御來對抗病原菌[32]。乳酸桿菌和雙歧桿菌作為可安全食用的益生菌，能夠降低血膽固醇[15]。補充益生元如乳果糖、寡果糖、菊糖可刺激胃腸肽釋放，具有調(diào)節(jié)機體食欲和能量代謝的作用[41]。但值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)給予TLR5基因敲除(TLR5-deficient，T5KO)小鼠富含可溶性纖維素菊糖(7.5%)飲食時，小鼠的膽紅素升高。說明過量攝入菊糖可能會引起肝臟損傷，因此應(yīng)當(dāng)在醫(yī)生指導(dǎo)下適當(dāng)補充益生元，以免對身體造成危害[42]。表1 總結(jié)了常用益生菌、益生元干預(yù)NAFLD或NASH的臨床研究現(xiàn)狀。FMT是一種全面調(diào)節(jié)腸道菌群的方式，已被證明能夠有效恢復(fù)健康的菌群組成[7]，并可用于治療艱難梭菌相關(guān)性腹瀉和偽膜性結(jié)腸炎，以及其他慢性腸道炎癥性疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏病等[32]。有研究表明，進行FMT后，HFD小鼠腸道菌群紊亂得到糾正，腸道緊密連接蛋白(Zonula occludens-1，ZO-1)增加，NASH明顯減輕[50]。但FMT治療NASH患者的臨床研究還未見有報道。

3.2 選擇性干預(yù)特定菌群(噬菌體治療)

使用特殊菌群或細(xì)菌產(chǎn)物干擾NASH也可能成為新的治療手段或藥物研發(fā)方向。有報道稱使用黏液阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)可改善肝功能、減輕氧化應(yīng)激、抑制炎癥、使腸道菌群正?；?，并逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的代謝紊亂[23]。一些次級膽汁酸產(chǎn)生菌如乳桿科菌(Lactobacillaceae)和毛螺科菌(Lachnospiraceae)表現(xiàn)出降低膽固醇的潛力，可以改善高脂飲食下的代謝異常狀態(tài)[51]；還有研究發(fā)現(xiàn)，由細(xì)菌產(chǎn)生的特定膽汁酸可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，恢復(fù)菌群的平衡狀態(tài)[7]。

通過研究細(xì)菌組成及豐度變化，在確定特定細(xì)菌影響NAFLD發(fā)生、進展的機制或二者具有因果關(guān)系后，可使用靶向特定細(xì)菌的噬菌體根除該細(xì)菌，消除其對NAFLD患者康復(fù)的不利影響，且不會影響其他細(xì)菌的正常功能[38]。例如使用噬菌體靶向根除HiAlc-Kpn后可有效緩解NAFLD模型鼠的細(xì)菌性自動釀酒綜合征及NASH[24]。Nature發(fā)表1項研究稱，對酒精性肝炎患者FMT誘導(dǎo)的小鼠肝病模型，使用以溶細(xì)胞糞腸球菌為靶點的噬菌體能降低肝臟中的溶細(xì)胞素，并消除小鼠的酒精性肝損傷[38]。說明噬菌體治療可以特異性地消除某種細(xì)菌，為精確修飾腸道菌群提供了一種可靠的方法。

表1 微生態(tài)靶向干預(yù)NAFLD的部分臨床試驗研究報告

4 結(jié)語

腸道菌群異常會進一步影響NAFLD的發(fā)生、進展，甚至形成惡性循環(huán)。如何利用腸道菌群改變或阻斷NASH的發(fā)展進程，尋找細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物作為潛在靶點對干預(yù)NASH十分關(guān)鍵。益生菌、益生元、FMT、噬菌體治療等都是有前景的新策略[52]。然而，特定的微生物菌株或菌群是否與NASH發(fā)生有因果關(guān)系，并成為其治療手段還未在機制上得到肯定。整個腸道菌群不能成為精準(zhǔn)控制的目標(biāo)，菌株間的協(xié)同效應(yīng)也缺乏探索。目前研究受到的限制包括：缺乏檢測完整腸道菌群及細(xì)菌易位的非侵入性方法，腸道特定細(xì)菌分離困難且培養(yǎng)要求嚴(yán)格等。但令人振奮的是，腸道菌群對于治療NASH有巨大的潛能，深入探索腸道菌群組成或?qū)镹AFLD帶來新的診斷手段和個性化治療方法。