董科迪，朱淵，鄧奇峰，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123

細(xì)胞死亡是機(jī)體在生理環(huán)境下胚胎發(fā)育和組織更新過(guò)程中的正?，F(xiàn)象，但當(dāng)受到一些外界刺激后也是應(yīng)對(duì)損傷的一種病理反應(yīng)。細(xì)胞死亡可分為意外細(xì)胞死亡(accidental cell death，ACD)和調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulated cell death，RCD)，其中發(fā)生在生理?xiàng)l件下的RCD也被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。ACD是一種極端的物理、化學(xué)或機(jī)械因素引起細(xì)胞質(zhì)膜破裂，幾乎是瞬間發(fā)生的不可逆細(xì)胞死亡形式；RCD則是涉及多種效應(yīng)分子參與的可調(diào)控信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主死亡。早期研究認(rèn)為只有凋亡才受到特定程序調(diào)控，將細(xì)胞凋亡的概念錯(cuò)誤地等同于PCD，以區(qū)分于當(dāng)時(shí)細(xì)胞壞死的概念，即ACD[1-2]。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)并定義了多種呈現(xiàn)壞死形態(tài)的RCD，如焦亡、壞死性凋亡、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)依賴性程序性細(xì)胞死亡和鐵死亡等[3]。

壞死性凋亡的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1988年，Laster等[4]發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死。此后其他研究者經(jīng)過(guò)大量篩選成功地用小分子化合物干預(yù)了TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，表明這種細(xì)胞死亡方式是可以被誘導(dǎo)和調(diào)控的，曾用“programmed necrosis”(程序性凋亡)描述這種細(xì)胞死亡方式[5]。2012年細(xì)胞死亡命名委員會(huì)(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)將其正式命名為necroptosis(壞死性凋亡)[6]。目前研究表明，壞死性凋亡在生理和病理?xiàng)l件下均可發(fā)生，如胚胎發(fā)育、急性腎損傷、心臟缺血/再灌注、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和微生物感染等[7-8]。隨著細(xì)胞死亡研究的深入，揭示了細(xì)菌侵入機(jī)體后引起的組織損傷和細(xì)胞壞死這一過(guò)程有多種RCD的參與。細(xì)胞的生死結(jié)局受到細(xì)菌和宿主兩者相互作用的調(diào)控，決定感染進(jìn)程和感染性疾病的結(jié)局。壞死性凋亡作為新發(fā)現(xiàn)的RCD之一，其在細(xì)菌感染領(lǐng)域的作用正逐步被揭開(kāi)。本綜述針對(duì)該方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，期望為該領(lǐng)域的研究者提供參考資料。

1 壞死性凋亡(necroptosis)

壞死性凋亡是由絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白(receptor interacting protein/receptor-interacting protein kinase，RIP/RIPK)調(diào)控的RCD。凋亡作為最早被發(fā)現(xiàn)和定義的RCD，其形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞皺縮，核染色質(zhì)濃縮邊集，膜起泡并形成凋亡小體。而發(fā)生壞死性凋亡的細(xì)胞具有類似壞死細(xì)胞的形態(tài)，如細(xì)胞體積增大、細(xì)胞器腫脹和細(xì)胞膜穿孔，最后細(xì)胞崩解[9]。細(xì)胞崩解釋放胞漿內(nèi)容物，引起損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)——白介素1α(interleukin-1α，IL-1α)、親環(huán)蛋白A(cyclophilin A，CypA)、高遷移率族蛋白1(high-mobility group protein B1，HMGB1)、組蛋白、尿酸、ATP和線粒體DNA等釋放[10]。在DAMPs中，由于CypA在較早階段釋放，HMGB1在后期釋放，兩者常分別用作壞死性凋亡早期和晚期檢測(cè)的生物標(biāo)記物[11]。DAMPs導(dǎo)致局部炎癥細(xì)胞募集，表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活，因此壞死性凋亡通常被認(rèn)為是一種炎性的細(xì)胞死亡方式[12]。相比之下，凋亡由于膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整而不引起機(jī)體顯著的炎癥反應(yīng)，是一種免疫沉默形式的細(xì)胞死亡[13]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡的后果不一定總是促炎的，也可通過(guò)消除產(chǎn)生細(xì)胞因子和炎性產(chǎn)物的細(xì)胞從而抑制炎癥反應(yīng)[14-15]。壞死性凋亡的啟動(dòng)是在RIPK1和不依賴RIPK1的其他因素刺激下，通過(guò)激活RIPK3繼而由混合系列激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)參與的有序激活反應(yīng)。壞死性凋亡分為依賴RIPK1的經(jīng)典途徑和不依賴RIPK1的非經(jīng)典途徑，可由TNF、FasL、干擾素(interferons，IFNs) 等細(xì)胞因子以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)等病原微生物成分觸發(fā)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

1.1 依賴RIPK1的經(jīng)典途徑

凋亡是依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。caspase-8作為一個(gè)分子開(kāi)關(guān)調(diào)控凋亡和壞死性凋亡等細(xì)胞死亡之間的平衡，其酶活性和蛋白支架功能決定著細(xì)胞執(zhí)行死亡的方式[16]。TNF引起的腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞凋亡相關(guān)；但在caspase-8酶活性受抑制時(shí)也可誘導(dǎo)依賴RIPK1的壞死性凋亡[17]。經(jīng)典的壞死性凋亡途徑是RIPK1磷酸化后通過(guò)其RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)與RIPK3作用，隨后由RIPK3自磷酸化和激活，與RIPK1實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的寡聚形成壞死小體(necrosome)[18]?；罨蟮腞IPK3通過(guò)募集并磷酸化MLKL使其發(fā)生構(gòu)象改變。MLKL寡聚化后被轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上形成孔道致膜破裂，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。除較早發(fā)現(xiàn)的TNFR1受體外，其他同屬于TNFR超家族的死亡受體，如TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAILR)和Fas等也可引起經(jīng)典途徑的壞死性凋亡[19]。

1.2 不依賴RIPK1的非經(jīng)典途徑

非經(jīng)典途徑是指在不依賴RIPK1的其他因素刺激下引發(fā)的壞死性凋亡。除RIPK1外其他含有RHIM的分子，包括干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)和DNA依賴性干擾素調(diào)節(jié)因子激活劑(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)，它們也可通過(guò)其結(jié)構(gòu)域與RIPK3相互作用引發(fā)下游事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。DAI也稱為Z-DNA結(jié)合蛋白1 (Z-DNA binding protein 1，ZBP1)，在干擾素受體(interferon receptor，IFNR)信號(hào)、病毒和細(xì)胞內(nèi)源性左旋形態(tài)的核酸(Z-nucleic-acid)刺激下，可直接激活RIPK3觸發(fā)DAI-RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡[20-22]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)可以誘導(dǎo)TRIF-RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡，如細(xì)菌LPS和內(nèi)體(endosome)中的dsRNA分別激活TLR3和TLR4后，通過(guò)TRIF進(jìn)行RHIM依賴性相互作用激活RIPK3[23]。

依賴RIPK1和不依賴RIPK1的壞死性凋亡途徑如圖1所示。

圖1 依賴RIPK1和不依賴RIPK1的壞死性凋亡途徑

2 細(xì)菌感染與細(xì)胞壞死性凋亡

細(xì)菌與宿主的相互作用，以及感染與機(jī)體抗感染免疫的相生相克，處于不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)變化和平衡的狀態(tài)。一方面細(xì)菌侵入機(jī)體后引起宿主組織和細(xì)胞的損傷，通過(guò)操縱細(xì)胞生死促進(jìn)自身播散及免疫逃逸；另一方面宿主通過(guò)調(diào)節(jié)自身細(xì)胞死亡來(lái)清除受感染的細(xì)胞和觸發(fā)抗感染免疫。病原微生物感染過(guò)程中存在多種細(xì)胞死亡方式，其中之一是壞死性凋亡。敲除壞死性凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白R(shí)IPK3或MLKL基因的小鼠在生理?xiàng)l件下均未見(jiàn)病理改變，但在感染過(guò)程中有不同于野生型小鼠的表型，如存活率、組織病變程度和細(xì)菌載量等[24]。

2.1 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)

MRSA是臨床上常見(jiàn)的毒性較強(qiáng)的化膿性細(xì)菌，主要通過(guò)接觸傳播引起皮膚感染，在某些情況下通過(guò)血流擴(kuò)散至其他組織和臟器引起膿毒血癥。MRSA入侵宿主后，中性粒細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞最早吞噬病原菌。2014年Greenlee-Wacker等[25]首次報(bào)道了吞噬體內(nèi)的MRSA誘發(fā)中性粒細(xì)胞壞死性凋亡。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中外毒素，如α溶血素(α-hemolysin，Hla)、多種白細(xì)胞毒素——LukAB與 PSMα等均可引起壞死性凋亡，是肺部炎癥性壞死的主要因素。在體外巨噬細(xì)胞感染模型中，證實(shí)通過(guò)抑制RIPK1或MLKL信號(hào)傳導(dǎo)及應(yīng)用毒素突變株感染均可減少細(xì)胞死亡[26]。金黃色葡菌球菌染色體上編碼的附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)系統(tǒng)參與多種毒力因子的表達(dá)調(diào)控，包括Hla、LukAB和 PSMα等外毒素。2018年Zhou等[27]以毒力因子調(diào)控系統(tǒng)為靶點(diǎn)，通過(guò)使用agr抑制劑減輕了MRSA感染過(guò)程中壞死性凋亡所致的小鼠肺炎。然而，在感染過(guò)程中壞死性凋亡對(duì)宿主組織器官造成損傷的同時(shí)也可減輕病原菌引起的病理性炎癥反應(yīng)。在皮膚感染和敗血癥模型中，Kitur等[28]觀察到Mlkl基因敲除小鼠和使用RIPK1或RIPK3抑制劑干預(yù)的小鼠體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡通過(guò)限制MRSA誘導(dǎo)的過(guò)度炎癥從而有利于機(jī)體維持對(duì)病原菌的清除功能。

2.2 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)

Mtb是引起人類結(jié)核病的病原體，主要通過(guò)飛沫傳播，以肺部感染多見(jiàn)，也可侵犯全身各器官系統(tǒng)。Mtb具有逃逸宿主免疫反應(yīng)并在健康個(gè)體中持續(xù)存在的能力。Mtb能抑制巨噬細(xì)胞凋亡同時(shí)引發(fā)細(xì)胞壞死，以延遲由凋亡觸發(fā)的適應(yīng)性免疫和通過(guò)使巨噬細(xì)胞壞死以逃避固有免疫[29]。Lalita課題組在斑馬魚(yú)感染模型中發(fā)現(xiàn)，感染的巨噬細(xì)胞TNF信號(hào)被激活，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)介導(dǎo)對(duì)病原菌的抗性[30]；但增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷活性的同時(shí)，過(guò)量的TNF會(huì)使巨噬細(xì)胞發(fā)生經(jīng)典途徑的壞死性凋亡，并將細(xì)菌釋放到胞外有利于其生長(zhǎng)的環(huán)境中[31]。Mtb感染也可引起人或小鼠巨噬細(xì)胞死亡，但與之前斑馬魚(yú)模型中Mtb引起壞死性凋亡有所不同，這一過(guò)程僅依賴RIPK3介導(dǎo)的線粒體功能障礙觸發(fā)細(xì)胞壞死，而與RIPK1無(wú)關(guān)[32]。Stutz等[33]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與此相符，他們通過(guò)敲除MLKL的基因或使用RIPK1抑制劑，未能對(duì)感染的人或小鼠巨噬細(xì)胞死亡產(chǎn)生影響；經(jīng)移植人的胚胎胸腺和造血干細(xì)胞后，具有人類固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的小鼠——免疫系統(tǒng)人源化小鼠感染結(jié)局也未發(fā)生改變。表明Mtb感染過(guò)程中壞死性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷，對(duì)宿主而言有利于減輕壞死性凋亡在結(jié)核病中引發(fā)的病理性損傷。

2.3 非傷寒沙門(mén)菌(non-typhoidal Salmonella，NTS)

NTS是主要的引起食源性腹瀉的革蘭陰性兼性胞內(nèi)菌，引起人類和動(dòng)物的沙門(mén)菌病。人感染后可發(fā)生急性胃腸炎，在免疫功能低下人群中還可導(dǎo)致腸道外侵襲性感染。機(jī)體的消化道腸上皮細(xì)胞作為腸黏膜屏障的重要組成部分，是抵抗病原菌侵入的門(mén)戶。有研究表明，在鼠傷寒沙門(mén)菌引起腸炎過(guò)程中，壞死性凋亡抑制蛋白caspase-8可以防止腸上皮細(xì)胞壞死性凋亡發(fā)生，維持腸屏障功能以抵御病原菌入侵[34]。另外Hu等[35]發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)菌分泌蛋白B(Salmonellaouter protein B，SopB)通過(guò)調(diào)控腸上皮細(xì)胞壞死性凋亡有助于細(xì)菌從胞內(nèi)釋放并播散。沙門(mén)菌突破腸黏膜上皮屏障后主要遭遇巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷。有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，I型干擾素(type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ)受體缺陷小鼠感染鼠傷寒沙門(mén)菌后存活率更高，細(xì)菌利用宿主IFN-Ⅰ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡，從而逃避固有免疫反應(yīng)[36-37]。另外，Young-Tae等[38]在巨噬細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)菌感染過(guò)程中microRNA-155上調(diào)，靶向RIPK1和RIPK3促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。由此可見(jiàn)腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡有助于沙門(mén)菌播散和免疫逃逸。

2.4 單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)

Lm是一種自然界廣泛分布的食源性致病革蘭陽(yáng)性菌。該菌可耐低溫生長(zhǎng)繁殖，常存在于冷藏食品中威脅人類健康。細(xì)菌通過(guò)機(jī)體消化道穿過(guò)腸屏障，經(jīng)血到達(dá)肝脾乃至中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤(pán)，引起敗血癥、急性肝損傷、腦膜炎和胎兒死亡等。體外巨噬細(xì)胞感染模型發(fā)現(xiàn)，李斯特菌成孔毒素(listeriolysin-O，LLO)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡[39]。小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)，Lm可引起肝臟枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)發(fā)生壞死性凋亡，KCs的死亡隨即招募單核細(xì)胞增殖分化為新的KCs替代死亡細(xì)胞和引發(fā)抗菌炎癥反應(yīng)[40]。雖然宿主可通過(guò)壞死性凋亡觸發(fā)自我修復(fù)和抗菌反應(yīng)，但這種死亡方式也導(dǎo)致肝損傷。Qian等[41]發(fā)現(xiàn)，Ripk1基因敲除小鼠可以通過(guò)減輕肝組織細(xì)胞壞死性凋亡、炎癥和線粒體功能障礙等，從而緩解Lm引起的肝損傷。最近還有研究者發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡執(zhí)行蛋白MLKL激活后不引起細(xì)胞壞死性凋亡，而是直接結(jié)合胞內(nèi)Lm對(duì)其殺傷，說(shuō)明在某些情況下宿主具有非依賴細(xì)胞死亡殺傷機(jī)制，是抵御外來(lái)病原菌的另一種防御策略[42]。

2.5 鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis，Yp)

Yp是烈性傳染病鼠疫的病原菌，曾引起中世紀(jì)歐洲的“黑死病”，人與嚙齒類感染動(dòng)物接觸或通過(guò)鼠蚤感染。細(xì)菌侵入機(jī)體后被巨噬細(xì)胞吞噬，在細(xì)胞內(nèi)繁殖并沿淋巴管到達(dá)局部淋巴結(jié)，引起出血壞死性淋巴結(jié)炎，繼而引發(fā)敗血癥。RIPK1作為激酶活化后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡[43]。Dan等[44]報(bào)道Yp可通過(guò)RIPK1、caspase-8和RIPK3導(dǎo)致凋亡和壞死性凋亡兩種巨噬細(xì)胞死亡方式。在耶爾森菌感染過(guò)程中，依賴RIPK1的巨噬細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生和抗菌反應(yīng)從而有利于宿主抵抗病原菌[45]。壞死性凋亡的作用與凋亡相反，研究報(bào)道Yp外膜蛋白(Yersiniaouter protein J，YopJ)引起的巨噬細(xì)胞死亡可促進(jìn)鄰近細(xì)胞感染，同時(shí)檢測(cè)到壞死小體形成以及磷酸化MLKL上調(diào)，證實(shí)了巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。通過(guò)小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞壞死性凋亡有利于Yp從胞內(nèi)釋放并在腹股溝淋巴結(jié)中播散[46]。

3 結(jié)語(yǔ)

壞死性凋亡對(duì)機(jī)體而言是一把“雙刃劍”，既作為一種細(xì)胞死亡方式，又是宿主免疫防御的重要組成部分；對(duì)病原菌而言，其作用隨感染的種類、入侵途徑、菌量和時(shí)相等多種因素而異。壞死性凋亡的雙重機(jī)制在抗感染時(shí)具有不同效應(yīng)：一方面影響細(xì)菌引起的炎癥、觸發(fā)宿主自我修復(fù)和抗菌反應(yīng)以清除病原菌；另一方面加重感染導(dǎo)致的病理性損傷和促進(jìn)胞內(nèi)菌釋放播散。進(jìn)一步探索壞死性凋亡機(jī)制及其相關(guān)蛋白的功能，以及與各種細(xì)胞死亡方式之間的關(guān)系，對(duì)認(rèn)識(shí)和揭示感染性疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。