李朋彥，周成慧，李潛，趙偉，羅學(xué)剛

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；3.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，南京 210046)

糖尿病、高脂血癥等糖脂代謝紊亂性疾病已成為威脅人類生活質(zhì)量及經(jīng)濟社會發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題[1]。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸促胰島素激素，在糖脂代謝的實時應(yīng)答調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2]。但天然的GLP-1在體內(nèi)不穩(wěn)定，半衰期僅約2 min，臨床可行性差[3]。利拉魯肽(liraglutide)是將人GLP-1(7-37)第34位的Lys替換為Arg(K34R)，同時在第26位Lys上引入一個由Glu介導(dǎo)的16碳棕櫚酸側(cè)鏈[4]。利拉魯肽保留GLP-1的全部生物活性，不良反應(yīng)顯著減少，且體內(nèi)半衰期可延長至13 h[5-6]。大量研究證實，利拉魯肽不僅具有高效、持久的降糖效果，且可顯著改善細胞功能，為2型糖尿病治療帶來福音[7-8]。但此藥物價格相對較高，而迄今國內(nèi)還沒有利拉魯肽生物類似藥獲批上市。筆者在本研究利用遺傳背景清楚、成本低、易于產(chǎn)業(yè)化的大腸埃希菌表達系統(tǒng)[9]，對GLP-1(7-37)K34R(簡稱GLP1a)的基因工程表達制備工藝進行探索研究。由于大腸埃希菌過量表達蛋白時常形成不可溶的包涵體[10]，且GLP1a相對分子質(zhì)量小(31個氨基酸)，對基因工程表達及分離純化都十分不利。為了提高目的蛋白的可溶性與及分離純化效率，筆者在本研究將目的蛋白分別與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、泛素(Ub)、小泛素相關(guān)修飾蛋白(SUMO)等3種不同標簽蛋白進行融合，分析比較其可溶性表達效果[11]。優(yōu)化表達工藝條件，最終通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和高效液相色譜(HPLC)對所獲目的蛋白進行分析確證。

1 材料與方法

1.1菌株和載體 大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)菌株DH5α、Rosetta(DE3)均為天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。pE-SUMO質(zhì)粒購自lifesensors，pET28a+、pGEX-6p-3質(zhì)粒均為本實驗室保存。

1.2主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20180610)，BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific公司，批號：EE60997A)，GLP-1(7-37)K34R標準品(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司)，限制性內(nèi)切酶(Fermentas公司，批號：LT02241)，T4 DNA連接酶(Thermo Scientific公司，批號：00353024)，Pfu DNA聚合酶(批號：K21029)和dNTPs(批號：M10316)購自北京康為世紀生物科技公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，PCR引物和Ub基因合成以及序列測序均由金唯智生物科技有限公司(蘇州)完成。

1.3glp1a系列表達載體的構(gòu)建與鑒定 通過glp1a的氨基酸序列，按大腸埃希菌密碼子偏愛性進行優(yōu)化后獲得編碼基因序列，同時，為了后續(xù)純化能切除融合標簽，在glp1a基因前面腸激酶切割位點的編碼DNA序列。文中所用引物序列見表1。glp1a基因是由3條引物通過重疊延伸PCR技術(shù)擴增得到的，首先以P1/F、P1/Z為引物，擴增得到片段A；然后以P1/F、P1/R為引物，片段A為模板擴增得到目的片段glp1a，回收目的片段。①將回收的glp1a目的片段利用引物P6/F、P6/R克隆到pGEX-6p-3表達載體的BamHⅠ和SalⅠ酶切位點之間，構(gòu)建表達載體pGEX-6p-3- glp1a。②化學(xué)合成Ub編碼DNA，將回收的glp1a目的片段和Ub利用引物P7/F、P7/R，通過重疊PCR整合到一起，將擴增產(chǎn)物連接到pET28a載體的EcoRⅠ和NcoⅠ酶切位點之間，構(gòu)建表達載體pET28a-Ub-glp1a。③將回收glp1a目的基因利用引物P9/F、P9/R克隆到pE-SUMO的BsaⅠ和HindⅢ酶切位點之間。構(gòu)建表達載體pE-SUMO-GLP1a。

表1 引物序列

將以上三個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，涂布于含有卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板，培養(yǎng)12～16 h，分別挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，將正確的質(zhì)粒送至測序公司，得到構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-GLP1a、pET28a-Ub-GLP1a、pE-SUMO-GLP1a。

1.4GLP1a蛋白的表達及SDS-PAGE分析 提取構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-3-GLP1a、pET28a-Ub- GLP1a和pE-SUMO-GLP1a。分別轉(zhuǎn)化E.coliRosetta (DE3)感受態(tài)細胞。挑取單菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg·mL-1)、氯霉素(34 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)菌液按2%接種量于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至吸光度(A600)為0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG，在25 ℃，200 r·min-1條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。同時以空質(zhì)粒pGEX-6p3、pET28a+和pE-SUMO轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)誘導(dǎo)培養(yǎng)作為陰性對照。

誘導(dǎo)完后，于4 ℃，10 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌菌體3次，超聲破碎菌體。破碎后未離心的標記為全菌體；12 000 r·min-1(r=13.5 cm)離心10 min，上清標記為上清液；沉淀標記為沉淀。3個樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，利用Odyssey成像，圖片經(jīng)Quantity one軟件分析各樣品上清液中目的蛋白的百分含量，根據(jù)BCA測定的各個菌體上清液中總蛋白濃度，計算出各菌體上清液中目的蛋白濃度。

1.5優(yōu)化蛋白表達 為提高目的蛋白在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中表達量，對關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，其中包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間[12]。

1.5.1誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 將上述構(gòu)建成功的目的菌株按2%接種量于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至A600為0.6時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，分別在25，30，37 ℃，200 r·min-1條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.5.2誘導(dǎo)時機的優(yōu)化 首先測定菌體在37 ℃培養(yǎng)時生長曲線，選擇A600為0.6，0.8和1.0時，分別用終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，按照前面得到的最佳誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)6 h。

1.5.3誘導(dǎo)時間優(yōu)化 用前面實驗得到最佳優(yōu)化溫度和時機，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG分別誘導(dǎo)4，6，8，10 h。

1.5.4IPTG濃度優(yōu)化 按照前面實驗優(yōu)化好的表達條件，分別加入0.2，0.4，0.6，1.0 mmol·L-1的IPTG進行誘導(dǎo)。

1.6GLP1a融合蛋白的純化和分析

1.6.1融合蛋白的純化 超聲裂解后的菌體，10 000 r·min-1(r=13.5 cm)，4 ℃離心10 min，收集上清液中可溶性的融合蛋白，并用孔徑0.45 μm濾膜濾過。加入和菌體上清液等體積結(jié)合緩沖液[20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.9)，10 mmol·L-1咪唑，0.5 mol·L-1氯化鈉]，將上清液稀釋后負載上柱。上樣完后使用結(jié)合緩沖液沖洗樹脂，洗脫和樹脂非特異性結(jié)合的雜蛋白。使用洗脫緩沖液[20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.9)，咪唑梯度，0.5 mol·L-1氯化鈉]進行洗脫，分別用10，50，100，300 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖液進行洗脫，收集300 mmol·L-1咪唑洗脫液。300 mmol·L-1咪唑洗脫液通過梯度濃度透析以除去咪唑和降低鹽離子濃度，再于50%甘油(10 mmol·L-1PBS配制)透析12 h，以濃縮目的蛋白。在濃縮后蛋白90 μL(約50 μg)中，加入2 U·μL-1重組腸激酶0.5 μL和10×緩沖液10 μL，最后用去離子水定容到100 μL，25 ℃酶切16 h。將酶切蛋白采用SDS-PAGE分析。

1.6.2高效液相色譜法分析 將酶切后回收蛋白利用高效液相色譜法分析。色譜條件：色譜柱：Jupiter Proteo 90A(4.6 mm×250 mm，4 μm)Phenomenex C12柱；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣體積：30 μL；檢測波長：215 nm；流動相A：磷酸二氫銨11.5 g，乙腈100 mL，85%磷酸調(diào)pH值至3.7，超純水定容至1 000 mL；流動相B：乙腈960 mL、水270 mL；精密稱取標品0.001 0 g，超純水定容至2 mL，超聲波溶解制得0.5 mg·mL-1的供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1GLP1a系列重組蛋白表達載體的構(gòu)建 對GLP1a基因進行大腸埃希菌的密碼子優(yōu)化，構(gòu)建3個表達載體質(zhì)粒pGEX-6p-3-GLP1a、pET28a-Ub-GLP1a和pE-SUMO-GLP1a，見圖1-A。質(zhì)粒通過BamHⅠ、SalⅠ雙酶切和PCR產(chǎn)物鑒定，見圖1-B中各電泳圖的1和2泳道所示，分別得到符合預(yù)期的目標條帶，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，再進行測序后，將測序正確的轉(zhuǎn)化子用于下一步試驗。

2.2GLP1a不同融合蛋白的可溶性表達分析 重組大腸埃希菌在25 ℃下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12 h，超聲裂解菌體，將得到空載菌株超聲裂解液、重組菌株超聲裂解液全菌體、裂解液上清液、裂解液沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后的pGEX-6p-3-GLP1a、pET28a-Ub-GLP1a、pE-SUMO- GLP1a相對分子質(zhì)量分別約為30 600，14 190，16 280，相對分子質(zhì)量與理論值一致。由圖可明顯看到融合GST、Ub和SUMO標簽后，蛋白主要以可溶形式表達，極大促進目的蛋白的溶解性。

2.3不同標簽融合GLP1a的表達條件優(yōu)化與比較

2.3.1E.coliRosetta(DE3)/pGEX-6p-3-GLP1a菌株的表達條件優(yōu)化 將菌株表達條件逐一進行優(yōu)化，見圖3。圖中可以看出，在A600值為0.6時，蛋白量最大。從本實驗在發(fā)酵8 h時，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)能充分供應(yīng)菌株的生長并產(chǎn)生較多的蛋白。將誘導(dǎo)的重組大腸埃希菌E.coliRosetta(DE3)/pGEX-6p-3-GLP1a在不同的溫度下誘導(dǎo)，25 ℃目的蛋白的產(chǎn)量較高，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，目的蛋白的產(chǎn)量持續(xù)降低。此外，在誘導(dǎo)劑濃度為0.4 mmol·L-1時蛋白量相對最大，因此確定最適的表達條件為在A600為0.6時添加濃度為0.4 mmol·L-1IPTG，以25 ℃的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)8 h。

A.pGEX-6p-3-GLP1a、pET28a-Ub-GLP1a、pE-SUMO-GLP1a質(zhì)粒的示意圖；B.M：marker；1.重組質(zhì)粒采用BamHⅠ和 SalⅠ雙酶切分析；2.PCR產(chǎn)物；3.空質(zhì)粒，采用BamHⅠ和 SalⅠ雙酶切分析。

A.pGEX-6p-3-GLP1a；M.分子量標記；1.誘導(dǎo)pGEX-6p-3；2.誘導(dǎo)pGEX-6p-3-GLP1a；3.裂解后上清液；4.裂解后沉淀。B.pET28a-Ub-GLP1a；Lane M.分子量標記；1.誘導(dǎo)pET28a；2.誘導(dǎo)pET28a-Ub-GLP1a；3.裂解后上清液；4.裂解后沉淀。C.pE-SUMO-GLP1a；M.分子量標記；1.誘導(dǎo) pE-SUMO；2.誘導(dǎo)pE-SUMO-GLP1a；3.裂解后上清液；4.裂解后沉淀。

①與A600=0.6比較，P<0.05；②與8 h比較，P<0.05；③與25 ℃比較，P<0.05；④與1 mmol·L-1比較，P<0.05。

2.3.2E.coliRosetta(DE3)/pET28a-Ub-GLP1a菌株的表達條件優(yōu)化 基于優(yōu)化E.coliRosetta(DE3)/pGEX-6p-3-GLP1a菌株蛋白表達的方法，對E.coliRosetta(DE3)/pET28a-Ub-GLP1a菌株的表達進行優(yōu)化，結(jié)果見圖4。當A600值為0.8時蛋白表達量相對最高，而A600在1.0時蛋白產(chǎn)量反而下降，說明在適當?shù)木w密度加入誘導(dǎo)劑對大腸埃希菌蛋白表達有重要的影響，對于該Ub融合表達質(zhì)粒，在A600為0.8時加入誘導(dǎo)劑時較為理想。較短誘導(dǎo)時間不能完全生長達到產(chǎn)酶高峰期[13]，隨著誘導(dǎo)時間的增加，蛋白產(chǎn)量增加，當誘導(dǎo)時間為8 h，Ub融合蛋白量相對最高。誘導(dǎo)溫度對蛋白的產(chǎn)量有極其重要的影響，當誘導(dǎo)溫度為30 ℃時，蛋白產(chǎn)量達到一個較大值。圖4可看出，隨著誘導(dǎo)劑濃度的增大，蛋白表達量增加，但當升至1.0 mmol·L-1時，蛋白產(chǎn)量下降。最終，確定最優(yōu)表達條件為在A600為0.8時添加濃度為0.8 mmol·L-1的IPTG，以30 ℃的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)8 h。

2.3.3E.coliRosetta(DE3)/pE-SUMO-GLP1a菌株的表達條件優(yōu)化 按照同樣的思路對E.coliRosetta(DE3)/pE-SUMO-GLP1a菌株的蛋白表達進行優(yōu)化。從圖5可看到A600值在0.8時，加入0.8 mmol·L-1IPTG，在30 ℃誘導(dǎo)8 h時蛋白表達量最高。

①與A600=0.6比較，P<0.05；②與8 h比較，P<0.05；③與25 ℃比較，P<0.05；④與1 mmol·L-1比較，P<0.05。

發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化后，GST-GLP1a、Ub-GLP1a、SUMO-GLP1a融合蛋白產(chǎn)量從優(yōu)化前44.8，59.3，53.5 mg·L-1增加到88，130，112 mg·L-1，通過比較三株菌融合蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)E.coliRosetta(DE3)/pET28a-Ub-GLP1a表達量最好。因此選取這株菌的表達蛋白作為后續(xù)純化的目標蛋白，進行蛋白純化。

2.4Ub-GLP1a融合蛋白的純化 將E.coliRosetta(DE3)/pET28a-Ub-GLP1a大腸埃希菌在30 ℃下，經(jīng)0.8 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)12 h，誘導(dǎo)完菌體超聲破碎后，上清液部分通過鎳親和層析純化Ub-GLP1a融合蛋白，分別用配置好的10，50，100，300 mmol·L-1咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫，結(jié)果可看出，融合蛋白Ub-GLP1a能夠很好地與Ni樹脂結(jié)合并被咪唑洗脫下來?？梢园l(fā)現(xiàn)純化后的Ub-GLP1a相對分子質(zhì)量是14 190，經(jīng)腸激酶酶切后得到的GLP1a相對分子質(zhì)量約為4600，相對分子質(zhì)量與理論值一致，見圖6。

2.5HPLC法檢測純化后的GLP1a融合蛋白 由于融合蛋白再次過鎳親和層柱，目的蛋白小，且蛋白量少，SDS-PAGE分析不靈敏，所以將穿透液通過HPLC分析。結(jié)果見圖7。HPLC分析結(jié)果顯示，與標準品比較，目的蛋白的出峰時間、保留時特征均完全正確。經(jīng)計算得出最終切除標簽蛋白后的GLP1a含量為15.95 mg·L-1。

3 討論

利拉魯肽原研藥是通過酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)，但是利用酵母表達利拉魯肽可能存在以下問題：酵母表達載體傳代不穩(wěn)定；分泌表達的產(chǎn)物會增加產(chǎn)物的抗原性，不利于治療；酵母高密度發(fā)酵難度較大[14]。利用大腸埃希菌表達，有繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便和遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢。

①與A600=0.6比較，P<0.05；②與8 h比較，P<0.05；③與25 ℃比較，P<0.05；④與1 mmol·L-1比較，P<0.05。

A.鎳親和層析Ub-GLP1a融合蛋白；M.分子量標記；1～5.用10，50，100，300，500 mmol·L-1咪唑洗脫Ub-GLP1a的裂解液；6.Ub-GLP1a細胞裂解液上清液；B.腸激酶酶切融合蛋白，M.分子量標記；1～3.經(jīng)腸激酶酶切后的融合蛋白；4～6.未經(jīng)酶切的融合蛋白；7.GLP1a標準品。

本實驗構(gòu)建GST、Ub、SUMO 3種不同融合標簽的大腸埃希菌表達載體。大量研究表明，菌體密度達到一定濃度后，目的蛋白表達量最高[15]。同時誘導(dǎo)溫度過高菌體生長速率及代謝都較快，產(chǎn)酶速率也同時加快，導(dǎo)致蛋白來不及進一步折疊，而致使大量包涵體的形成；培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)隨著發(fā)酵時間的延長會逐漸被消耗，影響菌體的正常生長代謝，使其產(chǎn)酶能力下降并產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，而較短發(fā)酵時間不能完全生長達到產(chǎn)酶的高峰期[16]；由于IPTG具有一定的毒害作用，當IPTG的濃度過高時會對細胞的生長產(chǎn)生毒害作用，使表達的產(chǎn)量降低[17]。最佳的誘導(dǎo)條件為：在A600為0.8時添加濃度為0.8 mmol·L-1的IPTG，以30 ℃誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)8 h，得到蛋白含量為130 mg·L-1。利用鎳柱親和層析對表達的Ub-GLP1a重組蛋白進行純化，將純化后的蛋白采用腸激酶酶切后經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析證明得到正確的目的蛋白。

A.標品；B.目的蛋白；1.GLP1a。

為了實現(xiàn)GLP1a的可溶性表達，本實驗利用融合標簽構(gòu)建表達載體。GST標簽是細菌表達系統(tǒng)中純化蛋白較為成功的標簽之一，可使蛋白正確折疊成有功能的區(qū)域[18]。Ub是由76個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，可增強蛋白表達效率，并且簡化蛋白純化過程[19]。SUMO蛋白具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[20]。不同的融合標簽賦予外源性目的蛋白新的特性，促進目的蛋白的正確折疊和溶解[16]。通過實驗，可以看出蛋白標簽對蛋白的表達量以及包涵體的形成有顯著影響。筆者在本文以大腸埃希菌為宿主，首次從不同蛋白標簽對表達GLP1a蛋白的影響方面進行了研究，提高蛋白的表達量和可溶性。