梁冰冰，唐成飛，何娟，姚華剛

(廣東藥科大學(xué)中山校區(qū)醫(yī)藥化工學(xué)院，中山 528400)

以順鉑為基礎(chǔ)的鉑類抗腫瘤藥物在臨床上取得巨大的成功，目前鉑類藥物仍然是癌癥治療的首選藥物[1-4]。與分子靶向藥物比較，順鉑具有療效顯著、治療費(fèi)用少、抗瘤譜廣等優(yōu)勢，適合癌癥患者使用。但鉑類藥物毒副作用(腎毒性、耳毒性及神經(jīng)毒性等)，水不穩(wěn)定及耐藥性問題在一定程度上限制其臨床使用[5]，促使人們尋找能替代順鉑的更高效、廣譜、無毒的新型金屬抗癌藥物，如鉑氮雜環(huán)卡賓配合物。1991年，ARDUENGO 等[6]首次分離得到游離氮雜環(huán)卡賓(N-heterocyclic carbene，NHC)，NHC是一種中性雙電子供體，因此易與缺電子試劑發(fā)生反應(yīng)生成新的物質(zhì)。NHC 在與金屬結(jié)合時(shí)，其所形成的 C-M 鍵強(qiáng)于 P-M 鍵，這種金屬氮雜環(huán)卡賓配合物除了應(yīng)用于化學(xué)反應(yīng)的催化外，近年來，過渡金屬(銀、金、銠和鉑等)NHC配合物在抗腫瘤活性研究中也顯示出良好的抗腫瘤活性[7-8]。本研究主要對已經(jīng)設(shè)計(jì)合成的兩種金屬鉑配合物4和5(以下簡稱配合物4和配合物5)，通過進(jìn)行細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取、定位細(xì)胞死亡方式等，然后進(jìn)一步探討它們的抗腫瘤活性和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 紫外-可見分光光度計(jì)(美國Varian公司 ，型號：Cary 300 )；熒光分光光度計(jì)(日本島津公司，型號： RF-301PC)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan 公司 ，型號：Infinite M200 Pro)。

1.1.2試藥 噻唑藍(lán) (MTT，批號：C10769615)、Hoechst染料、Annexin V-FITC試劑盒、Caspase-Glo?試劑盒、雙抗(青霉素-鏈霉素)(批號：2199839)均購于Sigma Aldrich公司；BCA試劑盒( Novagen Inc，USA )； 電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham Inc，USA)；聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore，USA )；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)(高糖型)，批號：8129333)、RPMI1640 培養(yǎng)基(批號：8129119)、澳洲胎牛血清(批號：2292602)均購于Hyclone Laboratoreis Inc.公司；正辛醇(批號：20190625)、無水乙醇(批號：20190701)均購于Alfa Aesar公司。

1.2配合物的合成 配合物的合成方法見文獻(xiàn)[9-10]。結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 鉑類金屬配合物4和配合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3細(xì)胞系及培養(yǎng)情況 人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、耐順鉑非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549R)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人類正常肝細(xì)胞(LO2)均來自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。 A549和A549R 細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中每毫升含青霉素100 U和鏈霉素100 μg。細(xì)胞置于細(xì)胞組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃ 恒溫箱，箱內(nèi)輸入氣體為 5%二氧化碳(CO2)和 95%空氣。耐順鉑細(xì)胞A549R使用添加順鉑 RPMI 164 培養(yǎng)，從而維持細(xì)胞對順鉑的耐藥性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所有細(xì)胞均加二甲亞砜(DMSO) (1%，V/V)作為對照組。

1.4親水親脂系數(shù)實(shí)驗(yàn) 配合物的親水親脂系數(shù)(lgPO/W)經(jīng)正辛醇/水經(jīng)典搖瓶法測定[11]。

1.4.1預(yù)飽和 取等體積的正辛醇和超純水混合，溶液放在搖床上以200×g搖動震蕩，預(yù)飽和48 h，靜置分層，分別獲得預(yù)飽和的水相和正辛醇相，標(biāo)記存放。

1.4.2鉑類金屬配合物樣品溶解分配 稱取少量樣品置于15 mL離心管中，分別加入預(yù)飽和的水相和正辛醇相各5 mL，將溶液置于水平搖床，以200×g搖動震蕩48 h 。靜置分層，分別得到配合物兩相溶液，以15 000 r·min-1離心5 min，濾過，去除未溶解的樣品沉淀。

1.4.3紫外吸收光譜測定 以甲醇為稀釋劑，等濃度稀釋兩相，分別測定吸光度(A值)。測定時(shí)，參比池中要相應(yīng)加入等體積不含藥物的預(yù)飽和水相或正辛醇相。盡量保證正辛醇和水相的甲醇稀釋體積相同，當(dāng)藥物在某相中分配過少(配合物多為水相)，可考慮增加所取體積進(jìn)行測試，但要將吸光度(A)值除以相應(yīng)擴(kuò)增比例。

1.4.4親水親脂系數(shù)的計(jì)算 lgPO/W=lg(AO/AW) ，式中AO與AW分別為配合物特定波長下正辛醇及水相中的A值。

1.5細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將HeLa細(xì)胞懸液加入到含有DMEM培養(yǎng)基的 100 mm Corning培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，放入培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長至約 70%時(shí)，將鉑配合物4或配合物5樣品加入到培養(yǎng)皿中，濃度10 μmol·L-1，孵育 12 h，同時(shí)以沒有加入藥物處理的細(xì)胞作為對照組。 孵育結(jié)束后，將各個(gè)培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)1～2 mL洗滌3次，加入 胰酶2 mL進(jìn)行消化2 min，然后加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基4 mL吹打均勻，離心4 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌2或3次；加入PBS 2 mL，吹打均勻，使其充分形成單細(xì)胞懸液，分別用于提取核、線粒體、總細(xì)胞[8]。

1.6蛋白免疫印跡分析 將HeLa細(xì)胞接種于 Corning 的 100 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 24 h后，分別加入配合物2.5，7.5 μmol·L-1，孵育 12 h，棄去皿中培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮收集所有細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌2次，加入 RIPA 細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，離心，收集上清液。用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離目標(biāo)蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜浸泡于封閉液中，室溫振搖2 h。然后與相應(yīng)的一抗( β-actin，γH2AX )孵育于4 ℃，振搖過夜。用含辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h 。最后是用增強(qiáng)的ECL試劑盒進(jìn)行信號檢測[12]。

1.7細(xì)胞電鏡拍攝實(shí)驗(yàn) 將HeLa細(xì)胞接種于Corning 的 100 mm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的配合物，于培養(yǎng)箱中避光孵育 12 h，然后不經(jīng)漂洗直接用細(xì)胞刮收集貼壁和懸浮細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀至粒徑2～5 mm，輕輕加入電鏡固定液1 mL，緩緩移入4 ℃冰箱暫存，4 ℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

1.8Caspase-3/7酶活性檢測 Caspase-3/7酶活性通過Caspase-Glo?試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書測定。

目前，工業(yè)裝配外骨骼主要類型有3種：第1種是以瑞士NOONEE公司[5]研發(fā)的Chairless chair為代表的椅子型工業(yè)外骨骼，它主要用于生產(chǎn)裝配車間，為工人提供長時(shí)間靜態(tài)支撐；第2種是以法國RB3D公司[6]研發(fā)的HERCULE V3為代表的力量輔助型外骨骼，它主要用于力量輔助、重物搬運(yùn)和工具操控；第3種是以美國洛克希德馬丁公司[7]推出的FORTIS為代表的工具支撐型外骨骼，它應(yīng)用范圍廣，可以輔助支撐多種類型工具。

2 結(jié)果

2.1配合物的親脂親水能力 配合物4和配合物5的lgPo/w分別為(0.99±0.03)和(1.73±0.08)，均為正值，說明二者都是親脂性，并且配合物5脂溶性大于配合物4。

2.2配合物的體外細(xì)胞毒性 結(jié)果見表1。對于 HeLa 細(xì)胞來說，配合物 4的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為(4.4±0.2)μmol·L-1，約是順鉑IC50值的4.0倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。配合物 4 對 A549R 細(xì)胞毒性約為順鉑對耐藥性細(xì)胞的毒性的 5.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 配合物對不同細(xì)胞株的 IC50值

Tab.1 IC50 values of tested compounds towards different cell lines

表1 配合物對不同細(xì)胞株的 IC50值

藥物HelaA549A549R順鉑17.3±1.022.7±1.056.2±3.2配合物44.4±0.2①②2.5±0.510.2±2.7①配合物58.2±0.2①3.8±0.212.2±2.6①藥物L(fēng)O2MCF-7順鉑20.1±2.329.7±1.2配合物44.2±2.112.4±2.3配合物56.6±0.614.2±2.1

①與順鉑比較，t=15.58～30.34，P<0.05；②與配合物5比較，t=22.03，P<0.05。

①Compared with cisplatin，t=15.58-30.34，P<0.05；②Compared with complex 5，t=22.03，P<0.05.

2.3ICP-MS細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) ICP-MS 結(jié)果表明，加藥 12 h 后處理腫瘤細(xì)胞的各細(xì)胞器，并且檢測其中鉑含量。結(jié)果表明，配合物4和配合物5在總細(xì)胞中鉑含量都明顯高于順鉑；經(jīng)過配合物4和配合物5處理后，細(xì)胞內(nèi)鉑主要分布在細(xì)胞核中，其中配合物5的總細(xì)胞攝取量高于配合物4，更高于順鉑的總攝取。

2.4配合物導(dǎo)致DNA損傷的研究 免疫印跡分析結(jié)果(圖3 )表明，配合物 4 在 425 nm 光照條件下能使 HeLa 細(xì)胞γH2AX 蛋白的磷酸化水平升高，并且對配合物具有濃度依賴性，配合物 4 能有效誘導(dǎo) DNA 損傷。

圖2 配合物的ICP-MS攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 配合物4對HeLa細(xì)胞γH2AX蛋白表達(dá)水平的影響

2.5配合物的細(xì)胞電鏡拍攝 掃描電鏡拍攝結(jié)果可以看出，與對照組細(xì)胞比較，配合物4處理的細(xì)胞空泡化現(xiàn)象比較明顯，放大倍數(shù)后觀察到細(xì)胞核膜破裂不完整、染色質(zhì)的染色體因發(fā)生濃縮而變深，以及凋亡小體的形成。見圖4。

圖4 電鏡下觀察配合物4對HeLa細(xì)胞的影響

3 討論

KIEIN等[13]合成Mono-Pt 配合物具有顯著的抗腫瘤活性，同時(shí)研究表明其配合物能夠通過自噬方式引起細(xì)胞死亡。為了研究已設(shè)計(jì)合成的金屬鉑配合物(Ⅱ)的生物活性，筆者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說明。本研究中配合物的親脂親水系數(shù)，結(jié)果表明，配合物4和配合物5均是親脂性的，說明配合物能夠通過主動運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞。并且配合物5的脂溶性大于配合物4，說明配合物5比配合物4更容易進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮作用。

為了研究配合物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，利用MTT檢測的方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物 4是這幾種金屬化合物中抗腫瘤活性最好的，其IC50值低于順鉑，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)配合物4對A549R細(xì)胞的毒性約為順鉑的5.5倍，說明配合物 4 能夠有效地克服順鉑的耐藥性。與配合物5比較，配合物 4 具有較高的細(xì)胞毒性(P<0.05)，說明將具有共軛面積更大的苯并喹啉配體與甲基苯硫醚配體配位，能夠有效協(xié)同增加鉑配合物的抗腫瘤活性。與配合物5比較，配合物4較好的抗腫瘤活性與其較高的脂溶性及高細(xì)胞攝取效率有關(guān)。

由于合成的配合物能夠有效殺死腫瘤細(xì)胞，但其在進(jìn)入細(xì)胞后的分布也是需要關(guān)注的問題。ICP-MS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入配合物 12h 后對細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測各細(xì)胞器中鉑含量，結(jié)果配合物4和配合物5進(jìn)入細(xì)胞都主要聚集在細(xì)胞核中，其中配合物5 的總細(xì)胞攝取量明顯高于順鉑；同時(shí)也高于配合物4的總細(xì)胞攝取量，這與配合物的脂溶性結(jié)果是一致的，表1的結(jié)果顯示配合物5 的脂溶性比配合物4 的好。與此同時(shí)，ICP-MS結(jié)果還可以看出配合物4的細(xì)胞器分布中，細(xì)胞核的鉑含量分布明顯高于線粒體等細(xì)胞器，表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒性和分布選擇性，因此配合物4更具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。

已有研究表明，該類金屬鉑配合物進(jìn)入細(xì)胞后主要集中在細(xì)胞核中，破壞腫瘤細(xì)胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)，如核內(nèi)DNA，發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞的作用[14]。γH2AX 蛋白是細(xì)胞核內(nèi)DNA相關(guān)特征性的抗體蛋白，配合物4能有效誘導(dǎo)核DNA的損傷，且濃度越高損傷越大，從而可以推斷在高濃度的配合物的作用下，腫瘤細(xì)胞能夠被有效的通過核損傷被殺死，達(dá)到有效抗腫瘤作用。通過掃描電鏡拍攝結(jié)果可以看出，配合物4處理后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)比較明顯的空泡化現(xiàn)象以及凋亡小體的形成，空泡化和凋亡小體是細(xì)胞晚期凋亡的主要特征。說明該配合物進(jìn)入細(xì)胞后引起細(xì)胞的凋亡，通過這種凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡的主要標(biāo)志性的原因過程目前多認(rèn)為是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 ( caspase ) 的被活化[15]。用Caspase-Glo試劑盒分析測定 caspase-3/7 的活性是否因?yàn)榕浜衔锏淖饔冒l(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配合物4和配合物5能夠激活腫瘤細(xì)胞的caspase-3/7 的活性，且具有濃度依賴性。這表明配合物引起細(xì)胞凋亡依賴于Caspase-3/7酶的激活。

綜上所述，本研究對設(shè)計(jì)合成的兩種新的金屬鉑(Ⅱ)配合物4和配合物5進(jìn)行生物試驗(yàn)，細(xì)胞攝取定位實(shí)驗(yàn)研究表明，兩種配合物進(jìn)入細(xì)胞后均定位在細(xì)胞核中，并且這些配合物在正常條件下表現(xiàn)相比順鉑具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性(P<0.05)，而且配合物 4 比配合物 5 表現(xiàn)得更明顯(P<0.05)。同時(shí)機(jī)制研究表明配合物 4在腫瘤細(xì)胞中顯著誘導(dǎo) DNA 的損傷，caspase-3/7 活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物在高濃度時(shí)對腫瘤細(xì)胞的影響是造成細(xì)胞的凋亡(P<0.05)。本研究結(jié)果對于卡賓配合物的抗腫瘤研究具有一定的參考價(jià)值，為類似新藥的設(shè)計(jì)合成提供了一定的研究基礎(chǔ)。

①與對照組比較，t=7.22～12.80，P<0.05。