朱克誠，劉寶鎖，傘利擇，劉 波，張 楠，郭華陽，郭 梁，江世貴，張殿昌

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300;2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室，廣東 廣州 511458;3.中國水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖研究開發(fā)中心,海南 三亞 572018;4.廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300）

在水生生物增殖放流活動中，利用人工繁育技術(shù)獲得的水生生物苗種質(zhì)量參差不齊，在被投放到天然水域后，隨即與本水域中的自然群體混合。許多研究表明，在遺傳多樣性指標(biāo)方面，假定放流群體與本水域自然群體存在一定差異，那么該自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)就有可能遭受破壞[1-5]。因此，針對放流苗種的遺傳質(zhì)量評估顯得尤為重要。“放流苗種遺傳質(zhì)量”被定義為自然種群與放流苗種群體遺傳多樣性指標(biāo)的吻合水平，對該放流而言，遺傳多樣性各項指標(biāo)一致性越高，說明該放流苗種的遺傳質(zhì)量越好[6]。

我國增殖放流的評價體系還不完善，放流苗種遺傳質(zhì)量監(jiān)測評估技術(shù)尚未健全，放流存在一定的盲目性，處于“粗放”的狀態(tài)[7-8]。苗種放流評估研究方面，胡鵬飛等[9]在免疫、消化和營養(yǎng)等方面針對放流的中國明對蝦苗種開展相關(guān)研究。此外，付亞男等[6]采用比對分析放流苗種和自然種群遺傳多樣性差異水平。

黃鰭棘鯛(Acanthopagrus latus)主要分布于我國南方近岸海域，近年來，由于環(huán)境污染、病害頻發(fā)、捕撈量過大等促使其自然種群衰退明顯[10]。國內(nèi)，有學(xué)者已經(jīng)開展關(guān)于黃鰭棘鯛增殖放流效果的評估以及標(biāo)記物的篩選分析[11-13]。朱克誠等[10]利用微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)手段篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記能為黃鰭棘鯛增殖放流、種群選育和分子輔助家系管理提供基礎(chǔ)信息?；谏鷳B(tài)系統(tǒng)通道(Ecopath) 模型，劉巖等[14]評估珠江口黃鰭棘鯛的生態(tài)容納量，提出有針對性地進(jìn)行增殖放流活動。吳仁協(xié)等[15]開發(fā)的47 個高多態(tài)性的黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記可以為鯛科魚類的種群遺傳學(xué)分析提供標(biāo)記來源。此外，有學(xué)者還從生理學(xué)[16-17]、病害[18-20]、肌肉發(fā)育[21-22]、性別調(diào)控[23]等方面解析其遺傳基礎(chǔ)。但是，關(guān)于放流前的黃鰭棘鯛苗種遺傳質(zhì)量評估的技術(shù)和方法未見報道。本研究參照付亞男等[6]的檢測方法，以黃鰭棘鯛為研究對象，從遺傳多樣性水平、遺傳分歧程度和近交程度等方面，比較分析黃鰭棘鯛自然群體和放流苗種群體的遺傳質(zhì)量，并詳細(xì)描述該苗種的放流遺傳特征，為魚類放流苗種的遺傳質(zhì)量評估提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物樣品采集與基因組總DNA 提取

2017 年12 月于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心實驗采集黃鰭棘鯛幼魚393 尾，平均體長（2.3±0.2）cm，該批苗種用于廣東省陽西縣沙扒鎮(zhèn)海域增殖放流，其親本來源于廣東省陽西縣沙扒海域附近海域的野生個體，數(shù)量為112 尾，雄魚74 尾和雌魚38 尾，平均體長（21.2±1.8）cm，平均體質(zhì)量（514±36）g。2017 年12 月于廣東省陽西縣沙扒鎮(zhèn)天然海域收集黃鰭棘鯛野生群體樣品共計36 尾。全魚和鰭條樣品分別來自于仔魚和野生群體，隨即于無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

用酚氯仿方法[24]提取黃鰭棘鯛放流苗種與自然群體的基因組DNA，提取的DNA 樣品最終稀釋成100 ng/μL，并利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 濃度和質(zhì)量的檢測，后續(xù)-20 ℃保存待用。

1.2 微衛(wèi)星等位基因分型

從該實驗室前期開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記中選取12個黃鰭棘鯛標(biāo)記[10]，分別對黃鰭棘鯛自然和苗種群體樣品進(jìn)行等位基因分型，各標(biāo)記的基本信息見表1。5′ 端帶有HEX、TET 和FAM 的熒光引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。本實驗隨機(jī)將12 個SSR 標(biāo)記分成4 組，標(biāo)記組合及其信息見前期研究基礎(chǔ)[10]。

表1 12 個微衛(wèi)星標(biāo)記引物特征Table 1 Primer characteristics of 12 microsatellite markers

PCR 反應(yīng)體系參考已發(fā)表的文獻(xiàn)描述[10]，PCR產(chǎn)物檢測方法同上。隨后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Short tandem repeats (STR) 測序分析(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，遺傳分析儀，ABI3730XL 全自動DNA 測序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測每個個體的基因型，GS-500 作為標(biāo)記。

1.3 種群遺傳多樣性和遺傳質(zhì)量

使用Arlequin version 3.5[25]計算觀察等位基因數(shù)(NA)、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、分析苗種與自然群體間的固定指數(shù)FST；概率測試（probabilitily test）來統(tǒng)計檢驗FST值的差異顯著性。多態(tài)信息含量(PIC)由PIC_CALC 0.6 軟件來分析計算。軟件GeneMarker V1.5 讀取等位基因大小。

利用軟件Coancestry 1.0[26]以“triadic likelihood estimator”模型來計算自然與苗種群體中個體的近交系數(shù)(inbreeding coefficient，F(xiàn))；使用軟件Fstat 2.93 以“連鎖不平衡法”（linkage disequilibrium methord）算法檢測各群體的FIS。

2 結(jié)果

2.1 放流苗種和自然群體遺傳多樣性水平

黃鰭棘鯛放流苗種與自然群體的遺傳多樣性指標(biāo)見表2。在放流苗種與自然群體中，利用12 個SSR 標(biāo)記分別檢測到119 和97 個等位基因。上述SSR 標(biāo)記在苗種群體中NA的分布范圍為5～ 16（平均值=9.917）；上述SSR 標(biāo)記在自然群體中NA的分布范圍為2～ 17（平均值=8.083）。

表2 黃鰭棘鯛放流苗種與自然群體遺傳多樣性指標(biāo)匯總Table 2 Summary of genetic variability of Acanthopagrus latus fingerling and natural stocks

苗種群體中各標(biāo)記的HO為0.321～ 0.848（均值0.646），HE為0.394～ 0.850（均值為0.694）；自然群體中各標(biāo)記的HO為0.306～ 0.944（均值0.674），HE為0.306～ 0.911（均值為0.707）。以上結(jié)果表明放流苗種和自然群體中的HE均大于HO，說明以上兩群體中的雜合子基因型存在缺失。

苗種群體中各標(biāo)記PIC 為0.315～ 0.827（均值0.654）；自然群體中各標(biāo)記PIC 為0.296～ 0.890（均值0.659）。

2.2 種群近交程度

放流苗種群體F均值為0.050 5，自然群體F均值為0.034 2。

放流苗種群體FIS值為0.051 8，自然群體FIS值為0.036 5。

2.3 放流苗種遺傳質(zhì)量分析

該研究利用遺傳多樣性水平、遺傳分歧程度、近交程度3 個方面中的6 個遺傳指標(biāo)，全面比較分析了放流苗種和自然群體的遺傳屬性，進(jìn)一步評價黃鰭棘鯛放流苗種的遺傳質(zhì)量。

首先，對放流苗種和自然群體在4 個種群遺傳多樣性水平指標(biāo)（NA、PIC 均值、HO均值、HE均值）（表3）進(jìn)行了對比分析。結(jié)果表明自然群體的PIC 均值、HO均值、HE指標(biāo)值均大于放流苗種群體，兩者之間的偏差率的范圍為-0.76%（PIC 均值）至 -4.15%（HO均值）。此外，放流苗種群體的NA均值高于自然群體的，偏差率為22.68%。

其次，種群間遺傳分化檢測結(jié)果顯示放流苗種和自然群體間的遺傳分歧指標(biāo)呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.001），分歧程度定義為“微弱”（FST=0.011 2）。這表明在等位基因頻率上，放流苗種群體與自然種群之間存在一定的微弱差異，其遺傳結(jié)構(gòu)仍存在差異。如果在該自然海域?qū)S鰭棘鯛苗種大量放流，則會導(dǎo)致自然種群等位基因頻率的改變，進(jìn)一步影響其遺傳結(jié)構(gòu)。

最后，結(jié)果表明放流苗種群體的F均值與FIS值均大于自然群體，兩者之間的偏差率分別是47.66%和41.92%，表明在種群近交程度上，苗種群體大于自然群體。如果在該自然海域?qū)S鰭棘鯛苗種大量放流，則會使自然種群近交程度增加，造成自然種群遺傳多樣性信息加速流失。

總而言之，基于上述種群遺傳學(xué)指標(biāo)，黃鰭棘鯛放流苗種大部分皆遜于自然群體，說明在遺傳質(zhì)量方面，該苗種在遺傳質(zhì)量方面不符合放流要求?；诟黜椫笜?biāo)的偏差率，近交系數(shù)最高（41.92%～47.66%），該放流苗種最突出的遺傳質(zhì)量缺陷，此外HE和HO偏差率較高（-4.15%和-1.84%），說明該苗種遺傳多樣性方面也存在一定質(zhì)量問題（表3）。

表3 黃鰭棘鯛放流苗種群體與自然群體遺傳學(xué)屬性比較Table 3 Comparisons of population genetic indicators between Acanthopagrus latus fingerling and natural stocks

3 討論

3.1 放流苗種遺傳質(zhì)量評估的重要性

開展增殖放流、發(fā)展增殖漁業(yè)，是改善水域環(huán)境、優(yōu)化漁業(yè)資源種群結(jié)構(gòu)和質(zhì)量、加強(qiáng)漁業(yè)資源恢復(fù)的一個重要途徑。這對于近海漁業(yè)資源可持續(xù)利用、漁民增收、漁業(yè)增效、開拓漁業(yè)發(fā)展空間都具有十分重要意義。截至目前為止，已有許多學(xué)者指出自然種群遺傳效應(yīng)能受到水生生物增殖放流的影響[1-4]。其中，在山東半島南部海域，中國對蝦放流苗種對其野生資源起到了較好補充效應(yīng)[27]。然而，也有Shan 等[5]在針對珠江河口黑鰭棘鯛的增殖放流苗種遺傳質(zhì)量評估研究中表明，與本水域自然種群相比較，黑鰭棘鯛的苗種群體遺傳多樣性水平較低，增殖放流后可能會影響自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)水平。付亞男等[6]指出紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）苗種的遺傳多樣性水平低于自然群體，不符合增殖放流中苗種遺傳質(zhì)量的需求。國外也有學(xué)者研究指出在近50 年內(nèi)的70 項有關(guān)放流遺傳結(jié)構(gòu)方面影響的成果，其中證實自然種群遺傳多樣性程度優(yōu)于放流苗種的有28 項，增殖放流對自然種群適應(yīng)力起到了負(fù)面影響的有23 項[1]。

可見，評估放流苗種質(zhì)量的優(yōu)劣是當(dāng)前迫切需要解決的任務(wù)。通過遺傳評估信息，可檢測自然與放流群體的遺傳結(jié)構(gòu)差異，可篩選掉遺傳信息含量較少的放流苗種，以及進(jìn)一步阻止含有較大差異遺傳信息的放流苗種流入天然海域，從而破壞水生生物原有的遺傳結(jié)構(gòu)。

3.2 黃鰭棘鯛自然種群的遺傳多樣性

黃鰭棘鯛是中國南海區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)海水魚類之一，年養(yǎng)殖產(chǎn)量突破了6 萬t。然而近年來，其自然種群嚴(yán)重衰退，遺傳資源量顯著下降[10,12,28]，而生物種質(zhì)資源的重要評價指標(biāo)是生物遺傳多樣性水平[29]。但是目前關(guān)于黃鰭棘鯛自然群體遺傳多樣性的研究報道很少。朱克誠等[10]選用了12 對微衛(wèi)星標(biāo)記對廣東省陽西縣海域黃鰭棘鯛自然群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)指標(biāo)分析，結(jié)果表明利用分離出來的標(biāo)記均具有豐富多態(tài)性。針對福建和珠江口2 個自然黃鰭棘鯛群體，楊慧榮等[28]利用RAPD 技術(shù)對其進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果表明珠江口和福建群體內(nèi)的遺傳變異水平都較高，但珠江口群體的遺傳變異程度較福建群體的高。有學(xué)者[30]也對廣西北海、廣東深圳、福建廈門三個黃鰭棘鯛的自然群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明其自然群體存在豐富的DNA 序列遺傳多樣性。此外，還有學(xué)者[10,15]僅僅開發(fā)了一些黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記，可為其遺傳資源研究提供一定的基礎(chǔ)資料。綜上所述，中國南海區(qū)域的黃鰭棘鯛自然群體的遺傳多樣性程度較高。

該研究除了檢測廣東陽江自然群體的等位基因數(shù)，多態(tài)信息含量和雜合度之外，還分析了近交系數(shù)F、FIS等，這些指標(biāo)可以反映種群適應(yīng)力的遺傳學(xué)指標(biāo)。從近交程度中的近交系數(shù)F均值和FIS指標(biāo)來看，目前廣東陽江黃鰭棘鯛自然群體沒有出現(xiàn)遺傳衰退的現(xiàn)象，遺傳適應(yīng)能力較強(qiáng)。有研究表明近交系數(shù)均值小于0.1，生物種群才能避免受到近交抑制的影響[31]。而該種群F均值為0.034 2，證明廣東陽江黃鰭棘鯛自然群體并沒有受到近交抑制影響。

3.3 黃鰭棘鯛放流苗種遺傳質(zhì)量評估

基于6 個遺傳參數(shù)，該研究比較了黃鰭棘鯛自然群體和放流苗種的遺傳特征（表3）。結(jié)果表明除等位基因數(shù)NA外，放流苗種遺傳多樣性水平中的多態(tài)信息含量PIC、觀測雜合度HO和期望雜合度HE均低于自然群體，此外自然群體近交指標(biāo)中的近交系數(shù)F和FIS也低于放流群體，表明放流苗種在多方面存在遺傳質(zhì)量缺陷。

影響水生生物放流苗種遺傳質(zhì)量的因素主要有三點：親本來源、數(shù)量和雌雄比例等[32]。該研究中的黃鰭棘鯛親本來源于前期捕撈收集的廣東陽江等海域的野生個體，表明了親本個體的優(yōu)良性。其次苗種親本隨機(jī)挑選于野生群體中，保證了親本雌雄比例的合理性。此外，該研究收集的苗種393尾來自約100 尾親本。Tajima 等[33]研究表明群體中個體數(shù)達(dá)到其有效種群大小的4～ 10 倍左右，才能促使該群體的遺傳信息一代一代穩(wěn)定傳遞。在針對紅鰭笛鯛增殖放流苗種評估的研究中，付亞男等[6]指出造成苗種遺傳質(zhì)量偏低原因可能是與“親本數(shù)量偏低”有關(guān)。而該研究中，黃鰭棘鯛的親本數(shù)量僅為112 尾，遠(yuǎn)低于放流苗種親本的合理數(shù)量，筆者推測黃鰭棘鯛放流苗種遺傳質(zhì)量缺陷可能是由親本數(shù)量不足導(dǎo)致的。親本的數(shù)量不足，會導(dǎo)致無法將完整的遺傳信息傳給下一代，造成子代遺傳信息不足。