劉泓宇，李立賢，AYIKU Stephen，唐 澤，范 煒，譚北平，董曉慧，遲淑艷，楊奇慧，章 雙，周文豪

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與高效飼料工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；4.北京英惠爾生物科技有限公司，北京 100081）

珍珠龍膽石斑魚是鞍帶石斑魚 (Epinephelus lanceolatus，) 與棕點(diǎn)石斑魚 (Epinephelus fuscoguttatus，♀) 的雜交種[1]。由于其飼料系數(shù)低，生長(zhǎng)速度快，適口性好，市場(chǎng)價(jià)值高，許多亞洲國(guó)家均有養(yǎng)殖[2]。我國(guó)南方各省市石斑魚養(yǎng)殖已形成一定規(guī)模[3]，然而集約化養(yǎng)殖的石斑魚易暴發(fā)傳染病，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

酵母水解物在水產(chǎn)飼料中多以酵母粉（酵母細(xì)胞失活后形成的蛋白類物質(zhì)）形式的單細(xì)胞蛋白，未進(jìn)行細(xì)胞壁裂解和酶解等深加工處理，未能充分釋放酵母細(xì)胞的內(nèi)含物質(zhì)，導(dǎo)致其功能性物質(zhì)的不能發(fā)揮到最大功效。酵母培養(yǎng)物是酵母菌在特定工藝條件下經(jīng)特定培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵的微生態(tài)制品[7]，含酵母細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物，以及變性培養(yǎng)基。酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖和甘露寡糖（MOS）成分有促進(jìn)免疫的作用，其中β-葡聚糖成分可激活巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子等免疫球蛋白，以幫助水生動(dòng)物抵御各種病原體[8]。酵母產(chǎn)物在魚類養(yǎng)殖業(yè)中潛在應(yīng)用優(yōu)勢(shì)日益增大，利用酵母產(chǎn)物改善魚類的生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。何遠(yuǎn)法等[9-10]發(fā)現(xiàn)，酵母培養(yǎng)物可顯著提高凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫力，并改善凡納濱對(duì)蝦腸道菌群多樣性。酵母培養(yǎng)物中的甘露寡糖可提高豹星斑（Mycteroperca rosacea）生長(zhǎng)性能、免疫力和抗病性[11]。雷宇杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著提高斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punetaus）生長(zhǎng)性能及飼料養(yǎng)分表觀消化率。草魚（Ctenopharyngodon idella）飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的酵母培養(yǎng)物可調(diào)節(jié)其腸道微生物區(qū)系，顯著提高氨基酸、脂肪代謝及消化能力[13]。

目前，酵母蛋白飼料研究中一般采用高蛋白含量固體發(fā)酵培養(yǎng)法，通過(guò)在發(fā)酵底物中添加非蛋白氮的方式來(lái)提高飼料蛋白質(zhì)的含量。已有酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚的生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)、抗氧化能力影響等研究[14-16]，本研究在此基礎(chǔ)上評(píng)估飼料中不同發(fā)酵底物 [含非蛋白氮（L）和不含非蛋白氮（N）] 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能、免疫應(yīng)答和腸道形態(tài)及抗哈維氏弧菌感染能力的影響，為珍珠龍膽石斑魚健康養(yǎng)殖研究及環(huán)保節(jié)能飼料開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

兩種不同發(fā)酵底物的酵母培養(yǎng)物（L，發(fā)酵底物含非蛋白氮，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)55%；N，發(fā)酵底物不含非蛋白氮，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，其他成分氨基酸、酸溶蛋白、甘露聚糖、核苷酸、活性肽基本一致）由北京英惠爾生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)飼料中礦物質(zhì)預(yù)混料購(gòu)自廣東湛江粵佳飼料有限公司，其他原料購(gòu)自廣東湛江市海寶飼料廠。所有原料粉碎后過(guò)孔徑250 μm 的篩，按照配方準(zhǔn)確稱取，混合均勻，放入V 型立式混合機(jī)中混合，緩慢加入所配飼料質(zhì)量25%～30%的水，混勻。用F-26 型雙螺桿擠條機(jī) (華南理工大學(xué)) 加工成粒徑為2.5 mm的顆粒飼料，室溫下風(fēng)干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約10%，用封口袋分裝，于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用珍珠龍膽石斑魚為湛江某養(yǎng)殖孵化場(chǎng)遺傳背景相同、無(wú)病原體的魚苗。實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)用玻璃鋼養(yǎng)殖桶暫養(yǎng)2 周，期間投喂商業(yè)飼料（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%左右）。攻毒用哈維弧菌（Vibrio harveyi）分離自廣東省海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病原生物學(xué)與流行病學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的患病珍珠龍膽石斑魚，在-80 ℃下凍存于含體積分?jǐn)?shù)25%胰蛋白酶的大豆蛋白胨中。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

配制5 種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的等氮等脂飼料，對(duì)照組（C0）含質(zhì)量分?jǐn)?shù)34%的魚粉，試驗(yàn)組L1 和L2 分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%的酵母培養(yǎng)物L(fēng)，N1 和N2 組分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%的酵母培養(yǎng)物N，分別記為C0(0%)、L1(2%)、L2(4%)、N1(2%)和N2(4%)。實(shí)驗(yàn)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)魚停飼12 h 后，取體質(zhì)量為（17.56±0.02）g 的幼魚450 尾，隨機(jī)放入15 個(gè)0.5 m3玻璃鋼養(yǎng)殖桶，每桶30 尾。每天9:00、17:00 按體質(zhì)量5%～ 8%飽食投喂。每天早上投喂前，各桶更換60%的海水。觀察飼料攝入量、石斑魚死亡率和水質(zhì)參數(shù)。養(yǎng)殖水溫（28.0±2.0）℃，pH 8.1±0.1，鹽度28～ 31，自然光周期，溶解氧6～ 8 mg·L-1。

1.3 樣本采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停飼24 h。記錄每個(gè)養(yǎng)殖桶中魚的數(shù)量和體質(zhì)量。每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)取魚11 尾，2 尾凍存在-20 ℃用于體成分分析；6 尾樣本尾靜脈中抽取血樣，在4 ℃靜置12 h 后，以3 500 r/min 離心10 min，上清液于-80 ℃下保存，用于酶活性測(cè)定；3 尾樣本于無(wú)菌條件下剖取中腸 (0.8～ 1.2 cm)，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，用于組織學(xué)分析。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)分析

實(shí)驗(yàn)8 周后，分別統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的投喂飼料總量。計(jì)算存活率、增重率 (WGR)、特定生長(zhǎng)率 (SGR) 和飼料系數(shù) (FCR)：

mf，平均終末體質(zhì)量 (g)；mi，初始體質(zhì)量(g)；t，飼養(yǎng)時(shí)間 (d)；mt，實(shí)驗(yàn)期間投入飼料量 (g)。

1.5 飼料和全魚的化學(xué)成分分析

使用AOAC (Association of Official Analytical Chemists,2005)[17]標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)配方飼料成分和魚體成分。在105 ℃的烘箱干燥樣品至質(zhì)量恒定。采用凱氏定氮儀（FOSS KT8400）測(cè)定蛋白含量。在550 ℃的馬弗爐中灼燒2 g 樣品4 h，測(cè)定灰分含量。使用脂肪測(cè)定儀（ANKOM XT15）測(cè)定粗脂肪含量。

1.6 血清免疫分析

使用南京建成公司的試劑盒用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ThermoFisher Multiskan GO）測(cè)定血清葡萄糖(SOD)、丙二醛 (MDA)、酸性磷酸酶 (ACP)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、堿性磷酸酶 (AKP)、溶菌酶 (LZM) 和免疫球蛋白(Glu)、總蛋白（TP）、甘油三酯 (TG)、膽固醇(CHO)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(IgM)。測(cè)定過(guò)程中嚴(yán)格遵循試劑盒的操作方法。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干基）Table 1 Formulation and proximate composition of experimental diets (dry matter) %

1.7 腸道組織學(xué)分析

取腸道組織，切片，厚度為5 μm，蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡 (Olympus,model BX51,Serial number:9K18395,Tokyo,Japan) 下觀察和拍照，使用Image-Pro Plus 6.3 (Media Cybernetics,Inc.，Rockville,USA) 軟件，測(cè)定放大100 倍時(shí)腸絨毛高度 (VH)、絨毛寬度 (VW) 和肌肉厚度 (MT)。每個(gè)切片取12 個(gè)測(cè)量值平均值。確定添加酵母培養(yǎng)物的飼料對(duì)魚類腸道形態(tài)的影響。

1.8 攻毒實(shí)驗(yàn)

將凍存的哈維氏弧菌置于裝有LuriaBertani(LB) 培養(yǎng)液的250 mL 平底燒瓶?jī)?nèi)，在培養(yǎng)箱中以37 ℃、180 r/min 條件振蕩培養(yǎng)20 h。以4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 沖洗2 次。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，3 d半致死濃度為3.58 × 105cfu/mL，因而用PBS 連續(xù)稀釋至3.58 × 105cfu/mL。經(jīng)過(guò)56 d 的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從每組中隨機(jī)取魚12 尾進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每尾魚注射200 μL 細(xì)菌懸浮液。另外從每組中取12 尾，分別注射同劑量的生理鹽水作為空白對(duì)照組（NC）。各組攻毒期間仍投喂相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)飼料。注射12 h后隨機(jī)取魚2 尾，采集血液樣本。樣品以4 ℃、3 500 r/min 的條件離心10 min。上清液于-80 ℃條件下保存，用于酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶（LZM）和免疫球蛋白M（IgM）的活性測(cè)定。記錄攻毒168 h 后各組的存活率。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（mean±SEM）表示，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Turkey 檢驗(yàn)，存活率數(shù)據(jù)則先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)、飼料利用率和存活率

表2 表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)性能有增加趨勢(shì)或顯著增加，其中N1 和N2 組的終末體質(zhì)量（FW）、增重率和特定生長(zhǎng)率最高（P＜ 0.05）。實(shí)驗(yàn)組飼料系數(shù)有降低趨勢(shì)或顯著降低，N1 和N2組飼料系數(shù)顯著降低（P＜ 0.05）。存活率分析結(jié)果顯示，L2、N1、N2 組存活率顯著提高（P＜ 0.05）。

表2 添加酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary yeast culture supplementation on the growth of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu

表2 添加酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary yeast culture supplementation on the growth of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)凡含一個(gè)相同字母表示組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；1) 反正弦平方根轉(zhuǎn)換值。Note:The data in same column with a same letter mean no significant difference between them at level of 0.05;1) arcsine of square root of percentage.

2.2 全魚體常規(guī)成分

表3 可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，飼喂酵母培養(yǎng)物飼料后，L1、L2 組粗蛋白顯著升高，N1、N2 組的干物質(zhì)、粗蛋白、灰分含量（干基）均有顯著提高（P＜ 0.05）。N2 實(shí)驗(yàn)組干物質(zhì)、粗蛋白、灰分含量顯著提高，而N1 組粗脂肪含量顯著增加（P＜ 0.05）。

表3 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚全魚常規(guī)成分的影響Table 3 Effects of dietary yeast culture supplementation on whole body composition of Epinephelus fuscoguttatus♀ ×E.lanceolatu

表3 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚全魚常規(guī)成分的影響Table 3 Effects of dietary yeast culture supplementation on whole body composition of Epinephelus fuscoguttatus♀ ×E.lanceolatu

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)凡含一個(gè)相同字母表示組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Note:The data in same column with a same letter mean no significant difference between groups at level of 0.05.

2.3 腸道消化酶

表4 可見(jiàn)，與對(duì)照組C0 相比，各實(shí)驗(yàn)組胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶均顯著升高（P＜ 0.05），L2組胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶平均值最高，顯著高于C0、N2 組（P＜ 0.05）。

表4 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道消化酶活性的影響Table 4 Effects of dietary yeast culture supplementation on the gastrointestinal digestive enzyme activities of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatuU/mg

表4 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道消化酶活性的影響Table 4 Effects of dietary yeast culture supplementation on the gastrointestinal digestive enzyme activities of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatuU/mg

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)凡含一個(gè)相同字母表示組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Note:The data in same column with a same letter mean no significant difference between groups at level of 0.05.

2.4 血清生化指標(biāo)

表5 可見(jiàn)，在飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著增加血清的總蛋白（TP）水平（P＜ 0.05）。N2 組TP含量最高（P＜ 0.05）。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組血清葡萄糖含量呈下降趨勢(shì)，N2 組平均值最低，與對(duì)照組有顯著差異（P＜ 0.05）。與對(duì)照組相比，除N1組甘油三酯（TG）顯著升高外，各組間TG 及膽固醇差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。各組間CHO 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。N2 組的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05）。

表5 添加酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary yeast culture supplementation on hematological indices of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu

表5 添加酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary yeast culture supplementation on hematological indices of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu

注：數(shù)據(jù)肩標(biāo)凡含一個(gè)相同字母表示組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Note:The data in same column with a same letter mean no significant difference between groups at level of 0.05.

2.5 血清抗氧化指標(biāo)

圖1 可見(jiàn)，攻毒12 h 后，N2 組血清SOD 活性顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05），但與L1、L2 和N1 組差異不顯著（P＞0.05）。N1 和N2 組CAT 含量（圖1_B）在攻毒12 h 后顯著高于其余三組（P＜ 0.05）。在攻毒前和攻毒12 h 后，酵母培養(yǎng)物處理組MDA 活性（圖1_C）顯著低于對(duì)照組 (P＜ 0.05)。攻毒12 h 后，N2組MDA 活性最低，顯著低于其余各組（P＜0.05）。

圖1 珍珠龍膽石斑魚攻毒前和攻毒12 h 后血清SOD,CAT 和MDA 含量變化Fig.1 Effects of dietary yeast culture supplementation on serum SOD,CAT and MDA response in Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu pre-challenge and 12 h after challenge

2.6 血清免疫指標(biāo)

圖2 可見(jiàn)，攻毒后12 h，N2 組血清酸性磷酸酶（ACP）含量顯著高于攻毒前（圖2_A），且顯著高于同期對(duì)照組（P＜ 0.05）。攻毒后12 h，L1、L2、N1 和N2 組血清堿性磷酸酶（AKP）活性無(wú)顯著差異（P＞0.05），但較攻毒前顯著提高（P＜0.05）（圖2_B）。各組血清溶菌酶（LZM）活性在攻毒前顯著低于攻毒后（圖2_C）（P＜ 0.05），L2和N1 組LZM 活性在攻毒后顯著高于同期對(duì)照組（P＜ 0.05）。攻毒12 h 后，N1 和N2 組免疫球蛋白（IgM）活性顯著升高（圖2_D），且顯著高于同期對(duì)照組（P＜ 0.05）。

圖2 珍珠龍膽石斑魚攻毒前和攻毒12 h 后血清ACP,AKP,LZM 和IgM 活性變化Fig.2 Effects of dietary yeast culture supplementation on serum ACP,AKP,LZM and IgM response in Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu pre-challenge and 12 h after challenge

2.7 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖3 和表6 可見(jiàn)，除L1 組外，添加酵母培養(yǎng)物后，其余各組絨毛高度 (VH) 和絨毛寬度 (VW)均顯著增加（P＜ 0.05），而N1 和N2 組間無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05）。實(shí)驗(yàn)組中肌肉厚度 (MT) 有所增加，與對(duì)照組相比，僅N1 組顯著增加P＜ 0.05）。

圖3 添加酵母培養(yǎng)物魚粉對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸絨毛高度、絨毛長(zhǎng)度和腸肌厚度的影響Fig.3 Effects of supplementation of fishmeal with yeast culture on villus height,villus width and intestinal muscle thickness of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu

表6 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道形態(tài)的影響Table 6 Effects of supplementation of fishmeal with yeast culture on intestinal morphology of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu μm

表6 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道形態(tài)的影響Table 6 Effects of supplementation of fishmeal with yeast culture on intestinal morphology of Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu μm

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)凡含一個(gè)相同字母表示組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Note:The data in same column with a same letter mean no significant difference between groups at level of 0.05.

2.8 哈維氏弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)

圖4 可見(jiàn)，攻毒168 h 后，注射生理鹽水組（NC）珍珠龍膽石斑魚無(wú)死亡記錄，酵母培養(yǎng)物處理組累積存活率與對(duì)照組相比差異顯著（P＜ 0.05）。N2實(shí)驗(yàn)組存活率最高 (80%)，對(duì)照組C0 存活率最低(20%)。

圖4 珍珠龍膽石斑魚攻毒168 h 后累積存活率Fig.4 Survival rate of 168 h in Epinephelus fuscoguttatus♀ × E.lanceolatu after challenged by Vibrio harveyi

3 討論

3.1 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

本研究表明，珍珠龍膽石斑魚飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著提高珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能和飼料利用率。N1、N2 組顯著提高體質(zhì)量、增重率、特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)，說(shuō)明發(fā)酵底物不含非蛋白氮的酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚的生長(zhǎng)性能和飼料利用率有較好的提升作用。這種良性影響可能與N1、N2 組酵母培養(yǎng)物的生物活性化合物（包括蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素和多糖）有關(guān)，以及飼料酵母培養(yǎng)物對(duì)腸道消化酶的影響有關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組消化酶活性顯著提高，表明腸道增強(qiáng)了對(duì)飼料的消化吸收能力，推測(cè)N1、N2 組激發(fā)了較高的消化酶活性，從而提高飼料利用率。劉明等[18]指出，飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)腸道消化酶活性，并降低飼料系數(shù)；李高峰[19]也報(bào)道了酵母培養(yǎng)物可顯著降低團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)飼料系數(shù)，與本研究結(jié)果一致。添加酵母培養(yǎng)物的飼料對(duì)珍珠龍膽石斑魚魚體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和灰分含量有顯著的積極影響，亦表明酵母培養(yǎng)物可增強(qiáng)水生動(dòng)物生長(zhǎng)和生理機(jī)能。以增重率為判據(jù)，添加酵母培養(yǎng)物可通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)腸道消化酶分泌，提高珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能，雖在發(fā)酵底物添加非蛋白氮可提高酵母培養(yǎng)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（55%），但與未添加非蛋白氮組（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%）相比生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異。

3.2 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清生化、抗氧化的影響

血清生化指標(biāo)與水生動(dòng)物的生理、營(yíng)養(yǎng)和疾病有密切聯(lián)系，可準(zhǔn)確反映水生動(dòng)物健康情況[20]。葡萄糖為魚類抗應(yīng)激代謝參數(shù)的指標(biāo)，本研究中，N2組珍珠龍膽石斑魚血清葡萄糖在飼喂酵母培養(yǎng)物后顯著降低，可能由酵母培養(yǎng)物中含免疫刺激劑β-葡聚糖所致[21]。酵母培養(yǎng)物主要成分除酵母菌體蛋白外，還含有大量β-葡聚糖、甘露寡糖[22]。在動(dòng)物體內(nèi)，β-葡聚糖可通過(guò)激活PI3K/AKT 途徑降低血糖。TG 和CHO 是魚類血脂的關(guān)鍵成分，二者含量高低可反映魚體脂類代謝狀況，高含量會(huì)對(duì)魚類肝胰臟產(chǎn)生損傷[23]。本研究中，用酵母培養(yǎng)物飼喂珍珠龍膽石斑魚時(shí)，除N1 組TG 顯著升高外，其余各組無(wú)顯著差異，且各組間CHO 無(wú)顯著差異。N1 組TG 的升高可能與酵母培養(yǎng)物添加量有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證?？傮w而言，飼料中添加酵母培養(yǎng)物不會(huì)對(duì)珍珠龍膽石斑魚造成不良影響。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加酵母培養(yǎng)物對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)血清中TG 和CHO 含量無(wú)顯著影響[24]，與珍珠龍膽石斑魚研究結(jié)果一致。

養(yǎng)殖動(dòng)物代謝活動(dòng)常產(chǎn)生多種活性氧 (ROS)，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激。SOD 可將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧氣，從而構(gòu)成抗氧化酶防御第一道防線，已用作確定魚類氧化應(yīng)激狀況分子標(biāo)志物[25]。CAT 為一種抗氧化酶，在水生動(dòng)物免疫反應(yīng)中可催化過(guò)氧化氫分子轉(zhuǎn)化為水和氧[26]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，反映了脂質(zhì)氧化的程度[21]。本研究中，N2 組血清SOD、CAT 含量攻毒后顯著高于對(duì)照組。與用酵母培養(yǎng)物飼喂凡納濱對(duì)蝦[9,27]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[28]和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punetaus)[29]的結(jié)果一致。N2 組MDA 含量攻毒后最低且顯著低于其余各組，與凡納濱對(duì)蝦飼料中添加酵母培養(yǎng)物的結(jié)果一致[24]。酵母培養(yǎng)物可增強(qiáng)抗氧化能力可能與酵母細(xì)胞富含維生素有關(guān)（B 族復(fù)合維生素可降低單核細(xì)胞中由H2O2引起的氧化應(yīng)激[30]）。本研究中，N 組抗氧化水平高于L 組，這可能與兩種酵母培養(yǎng)物的發(fā)酵方式有關(guān)，L 組發(fā)酵底物含非蛋白氮，而N 組發(fā)酵底物不含非蛋白氮。具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。AST 和ALT是存在于肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的可溶性酶，其活性增強(qiáng)反映了肝損傷[31]。通過(guò)血清ALT 和AST 水平可知，酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚并無(wú)不良影響，與草魚的相關(guān)研究結(jié)果一致[32]。推測(cè)酵母培養(yǎng)物在保護(hù)肝臟組織的同時(shí)，可增強(qiáng)魚類的抗氧化免疫系統(tǒng)。

LZM、AKP、ACP、TP、IgM 等先天免疫指標(biāo)常用于魚類的非特異性免疫監(jiān)測(cè)。TP 是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，保護(hù)魚類免受潛在入侵生物的侵害[33-35]。本研究中，N2 組顯著提高血清TP。在凡納濱對(duì)蝦[36]中亦有類似結(jié)果。ACP 和AKP 是魚類體內(nèi)重要的溶酶體酶，可水解和消化入侵的病原體，在免疫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是免疫系統(tǒng)巨噬細(xì)胞活化的特征標(biāo)記物[36]。魚體ACP 和AKP 活性升高表明免疫力相對(duì)增強(qiáng)。在珍珠龍膽石斑魚的飼料中添加甘露寡糖可刺激魚類的AKP 活性[37]。LZM是一種天然免疫酶，可溶解和消化感染性細(xì)菌。IgM是魚血清的主要免疫球蛋白，可作為反映魚免疫狀態(tài)的標(biāo)志物[38]。大量研究表明，酵母培養(yǎng)物對(duì)天然免疫反應(yīng)有積極影響。在烏蘇里鲇（Pseudobagrus ussuriensis）中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的飼料酵母培養(yǎng)物可提高血漿中ACP、AKP 和血清中LZM 含量，表明先天免疫反應(yīng)得以改善[39]。飼料中添加兩種組合的酵母培養(yǎng)物可改善虹鱒（Oncorhynchus mykiss）先天免疫反應(yīng)[40]。雷宇杰等[29]研究表明，飼料添加酵母培養(yǎng)物可提高斑點(diǎn)叉尾鮰血清LZM 的含量。李高峰[19]研究證實(shí)，團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)飼料中酵母培養(yǎng)物的添加可提高其非特異性免疫反應(yīng)。飼料中添加酵母培養(yǎng)物可增強(qiáng)異育銀鯽(Carassius auratus gibelioCAS Ⅲ)[41]和凡納濱對(duì)蝦[18]的非特異性免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，攻毒后N2 組血清ACP、AKP 含量顯著高于對(duì)照組，而LZM 含量高于對(duì)照組但無(wú)顯著差異。此外，N2 組IgM 攻毒后含量最高且顯著對(duì)照組，再次表明飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%酵母培養(yǎng)物可增強(qiáng)珍珠龍膽石斑魚的非特異性免疫應(yīng)答。酵母培養(yǎng)物可提高魚類免疫力可能與其含有的甘露寡糖以及β-葡聚糖有關(guān)。有研究表明，甘露寡糖和β-葡聚糖可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)[42]，β-葡聚糖可與水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞活性，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，從而清除機(jī)體內(nèi)病原微生物[43]。甘露寡糖有一定的免疫刺激作用，可與Toll 樣受體4(TLR-4)結(jié)合，提高機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[44]。本研究表明，N 組石斑魚先天免疫反應(yīng)的改善高于L 組，N 組中以N2 組酵母培養(yǎng)物效果最佳。這是否與酵母培養(yǎng)物發(fā)酵底物中非蛋白氮的添加有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道形態(tài)和抗病力的影響

腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)對(duì)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維持正常功能至關(guān)重要[45-47]。絨毛在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和提高生長(zhǎng)性能方面有重要作用[48]，腸壁功能取決于絨毛長(zhǎng)度。建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）幼魚飼料中添加酵母水解物可增加腸道絨毛高度，提高生長(zhǎng)性能[49]。此外，酵母培養(yǎng)物中的甘露寡糖增加凡納濱對(duì)蝦的腸道絨毛長(zhǎng)度[50]，說(shuō)明飼料甘露寡糖可有效調(diào)控腸道絨毛結(jié)構(gòu)。本研究中，飼料添加酵母培養(yǎng)物對(duì)珍珠龍膽石斑魚的絨毛高度和寬度有顯著促進(jìn)作用，從而進(jìn)一步提高石斑魚的生長(zhǎng)性能，可能與酵母培養(yǎng)物中含甘露寡糖有關(guān)。

養(yǎng)殖動(dòng)物傳染病暴發(fā)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。弧菌是石斑魚傳染病的病原體之一，常導(dǎo)致集約化高密度養(yǎng)殖的石斑魚大量死亡，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[51-55]。本研究中，飼以添加酵母培養(yǎng)物飼料，珍珠龍膽石斑魚對(duì)哈維氏弧菌有顯著的抵抗作用，尤其是N2 組。與飼以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酵母培養(yǎng)物對(duì)蝦的研究結(jié)果一致[56]。對(duì)哈維氏弧菌的抵抗力增強(qiáng)，表明酵母培養(yǎng)物可刺激和延長(zhǎng)珍珠龍膽石斑魚對(duì)病原性感染的免疫應(yīng)答。

4 結(jié)論

本研究表明，在珍珠龍膽石斑魚飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著提高其生長(zhǎng)性能、血清免疫力和抗菌能力。還對(duì)腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)有積極影響。在本實(shí)驗(yàn)條件下，以增重率、免疫指標(biāo)和累積存活率為判據(jù)，飼料中添加4%的酵母培養(yǎng)物 (發(fā)酵底物不含非蛋白氮) 對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)性能、免疫和抗病能力有最顯著促進(jìn)作用，發(fā)酵底物添加非蛋白氮可提高酵母培養(yǎng)物粗蛋白含量，但與未添加非蛋白氮組相比對(duì)生長(zhǎng)性能并無(wú)顯著促進(jìn)作用。