嚴金昌， 肖英平， 王遠霞， 呂文濤， 李景上， 楊 華， 劉秀婷*

（1．嘉興市秀洲區(qū)王店鎮(zhèn)政務服務中心，浙江嘉興314011；2.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質量安全危害因子

與風險防控國家重點實驗室（籌），浙江農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量標準研究所，浙江杭州310021）

隨著我國集約化、規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)上通常對仔豬實施早期斷奶，但由于早期斷奶仔豬的消化道發(fā)育尚未完善，消化液及相關酶分泌不足，胃腸道的微生態(tài)區(qū)系不穩(wěn)定且腸道的免疫功能低下，同時斷奶過程中仔豬還需要經(jīng)受環(huán)境、心理、營養(yǎng)等一系列的應激，因此早期斷奶會給仔豬的正常生長發(fā)育帶來一系列的影響，如厭食、生長遲滯、消化機能紊亂、腹瀉水腫、飼料利用率低等不良現(xiàn)象，稱為“仔豬早期斷奶綜合征”，嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益（寇莎莎等，2018；Wijtten等，2011）。早期斷奶的仔豬采食量降低，需要消耗體內(nèi)的脂肪以供機體的代謝需要（李國俊和崔榮飛，2018）。

參與肝臟脂類代謝的關鍵酶包括ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）、乙酰CoA羧化酶（ACC）和脂肪酸合成酶（FAS）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）也是啟動脂肪動員的關鍵脂肪酶，其能特異性地水解甘油三酯（TG）的第一酯鍵，是TG水解過程的限速酶（Luca等，2019；Zimmerman等，2004）。固醇調節(jié)元件結合蛋白-1（SREBP-1）是細胞內(nèi)調控脂類代謝的關鍵轉錄因子，主要通過促進脂肪和膽固醇合成中關鍵酶基因的表達來促進脂質新生（吳鐵梅等，2016）。

早期斷奶仔豬的機體代謝狀況必然發(fā)生變化，然而仔豬機體的脂類物質含量變化及肝臟和脂肪代謝相關基因的表達水平變化仍然未知。因此，本試驗擬通過研究早期斷奶對仔豬機體脂類物質含量和肝臟及脂肪組織中脂類代謝相關基因表達水平的影響，探究影響早期斷奶仔豬代謝的關鍵因素，為早期斷奶仔豬的營養(yǎng)代謝功能調控研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選取4個窩的16頭18日齡仔豬，將來自于不同窩的4頭仔豬稱重，采血后直接用于屠宰取樣，作為基礎數(shù)據(jù)；另外12頭進行斷奶處理，為斷奶組，每4頭一起飼養(yǎng)在與母豬欄環(huán)境相同的小欄中，飼喂配合飼料。母豬正常哺乳窩中剩余的仔豬，為非斷奶組。在斷奶后第1、3、7天（分別對應仔豬19、21、25日齡），從斷奶組和非斷奶組各取4頭仔豬稱重，采血后屠宰取樣。試驗期間自由飲水和采食。哺乳母豬飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1（楊華等，2018）。仔豬飼料由浙江國茂飼料有限公司提供，參考美國NRC（1998）標準配制，具體組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 哺乳母豬飼糧組成及營養(yǎng)水平（飼喂基礎）

1.2 樣品采集 于分組處理后0、1、3 d和7 d分別從斷奶組和非斷奶組選取4頭仔豬進行前腔靜脈采血，4℃下3000g離心10 min后得到血清樣本，然后屠宰取肝臟與背最長肌樣本，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 斷奶仔豬飼糧組成及營養(yǎng)水平（飼喂基礎）

1.3 血清脂類物質含量的測定 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒分析血清中甘油三酯（TG）、膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）指標，試驗操作按照相應的檢測試劑盒說明書進行。

1.4 脂類代謝相關基因表達分析 采用總RNA抽提試劑盒提取肝臟組織的總RNA，利用Nano Drop微量分光光度計測定RNA的純度，以OD260nm/OD280nm評價RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用Invitrogen反轉錄試劑盒SuperscriptTMⅡRTase反轉錄cDNA。

采用Premier 6.0和Beacon designer軟件進行目的基因和18S rRNA內(nèi)參基因引物的設計，引物序列見表3。采用TaKaRa SYBR實時熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM進行基因的實時熒光定量檢測。PCR擴增反應體系為25μL，具體 如 下：ddH2O 10.5μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，上、下游引物各1μL，cDNA模板1.0μL。反應條件：95℃，1 min；45個循環(huán)：95℃，10 s；62℃，25 s；由55℃連續(xù)上升到95℃，每5 s溫度上升0.5℃，以制備熔點曲線。

表3 脂肪合成相關目的基因和18S rRNA內(nèi)標基因引物參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理 肝臟基因表達數(shù)據(jù)根據(jù)系統(tǒng)自動分析的ACL、FAS、ACC、ATGL和SREBP 1以及18S rRNA標準曲線的斜率得到PCR擴增效率（E），E=10（-1/slope）。ACL、FAS、ACC、ATGL和SREBF 1的擴增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，以目的基因mRNA的拷貝數(shù)與對應樣品內(nèi)參基因mRNA的拷貝數(shù)的比值來表示基因mRNA的相對表達量，各個基因的相對表達水平以2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。每個待測樣品設置3個重復，對檢測得到的3個Ct值取算術平均值（楊華等，2018）。血清中脂類物質的含量以及基因表達所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析。試驗結果采用“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 早期斷奶對仔豬血清脂類物質含量的影響從圖1可看出，早期斷奶可顯著降低仔豬血清TG、總膽固醇、HDL和LDL含量，并表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，在斷奶后第3天開始下降。

與非斷奶仔豬比較，仔豬在斷奶后的第3、7天，血清TG含量分別降低了26.51%（P＜0.05）和36.71%（P＜0.05）；膽固醇含量分別降低了26.18%（P＜0.05）和40.93%（P＜0.05）；HDL含量分別降低了29.69%（P＜0.05）和31.34%（P＜0.05）。斷奶仔豬血清LDL含量在斷奶后的第1、3、7天分別比非斷奶仔豬降低了24.05%（P＜0.05）、37.65%（P＜0.05）和23.17%（P＜0.05）。

圖1 早期斷奶仔豬和對應同日齡哺乳仔豬血清TG、膽固醇、HDL和LDL含量

2.2 早期斷奶對仔豬肝臟脂類代謝相關基因表達的影響 由圖2可知，早期斷奶處理可提高仔豬肝臟中ACL基因的表達水平，但是肝臟中ACC、FAS和SREBP-1基因的表達水平降低，并表現(xiàn)為一致的變化趨勢。與非斷奶同日齡仔豬比較，在斷奶后第1、3、7天，斷奶仔豬肝臟ACL基因的mRNA表達水平分別提高了113.33%（P＜0.05）、106.15%（P＜0.05）和100.00%（P＜0.05），ACC表達水平分別降低了26.67%（P＜0.05）、53.51%（P＜0.05）和33.86%（P＜0.05），F(xiàn)AS表達水平分別降低了72.57%（P＜0.05）、85.71%（P＜0.05）和27.66%（P＜0.05），SREBP-1表達水平分別降低了58.72%（P＜0.05）、47.69%（P＜0.05）和11.69%（P＜0.05）。

2.3 早期斷奶對仔豬脂肪組織脂類代謝相關基因表達的影響 如圖3所示，早期斷奶使仔豬皮下脂肪組織中ATGL的表達水平升高，使FAS的表達水平降低。在斷奶后的第1、3、7天，脂肪組織中ATGL表達水平分別升高了51.02%（P＜0.05）、50.00%（P＜0.05）和26.50%（P＞0.05），F(xiàn)AS表達水平分別降低了73.33%（P＜0.05）、60.17%（P＜0.05）和37.10%（P＜0.05）。

3 討論

哺乳動物多余的能量主要以甘油三酯（TG）的形式儲存在脂肪組織中，當動物處于饑餓或當機體能量匱乏時，貯存的脂質就會發(fā)生脂解，由TG分解成非酯化的脂肪酸，釋放進入血液參與新陳代謝提供能量，脂肪的儲存及動員處于動態(tài)平衡狀態(tài)（Bell等，2005；Flier，2004）；沉積發(fā)生在仔豬初生后的各個生長發(fā)育階段。Lodge等（1978）研究指出，初生時期仔豬的體脂肪含量僅為1%～2%（脂肪型豬約為4%），隨著日齡增加脂肪沉積逐漸增多，1周齡時體脂量約7%，2周齡時為12%～15%，到4周齡時體脂量是初生時的90倍左右，但是體重僅為5倍多；16周齡后，雖然脂肪沉積量仍在增加，但其脂肪合成率開始下降。

早期斷奶的仔豬因受到斷奶應激的影響，會通過消耗機體的脂肪以滿足其代謝需要。ACC和FAS是體內(nèi)脂肪酸合成的關鍵酶。ACC是長鏈脂肪酸從頭合成的限速酶，催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，其活性的高低可影響肝臟及肌肉組織中的脂肪代謝（Sone等，2016）。FAS存在于脂肪、肝臟及肺等組織中。動物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多來自于脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰CoA和丙二酰CoA生成長鏈脂肪酸，然后再合成甘油三脂（TG）（Simith等，2003）。FAS活性的高低直接控制著體內(nèi)脂肪合成的強弱，對控制動物體脂的沉積具有重要的調控作用（Wang等，2004）。FAS表達水平升高能顯著增加TG在體內(nèi)的沉積，從而導致肥胖。脂肪組織中FAS與酮體脂肪量及脂肪率成極顯著正相關。通過抑制FAS的活性，可阻滯脂肪產(chǎn)生通路，減少脂肪合成，升高丙二酰CoA濃度，從而達到降低飲食的目的。

在仔豬早期斷奶階段，采食日糧由含乳糖、乳蛋白和乳脂等易于消化的液態(tài)乳汁轉變成以玉米-豆粕為主的固態(tài)日糧，日糧的轉變使其采食量急劇下降，能量攝入驟減，從而導致仔豬能量代謝處于負平衡狀態(tài)（Xiao等，2012）。Pié等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，仔豬在斷奶后的24 h內(nèi)僅采食到了11 g飼糧，在斷奶后2 d和8 d分別增加至214 g和384 g。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，早期斷奶仔豬血清中TG、膽固醇、HDL、LDL等脂類物質含量均降低，同時肝臟ACC、FAS和SREBP-1基因表達水平顯著降低，脂肪組織中FAS基因表達水平也相應地降低，表明早期斷奶使仔豬脂肪合成能量下降，仔豬早期斷奶階段為了維持機體的能量供給，動員已儲存的脂肪，通過脂肪的脂解作用，保障機體能量代謝的平衡。ACL是糖代謝與脂肪酸合成代謝之間的橋梁，位于脂質代謝通路的最上游，其活性受磷酸化和去磷酸化途徑的調節(jié)，磷酸化酶是ACL活性形式（Sun等，2010）。研究表明，在早期斷奶仔豬的肝臟中ACL基因表達量升高，這可能是由于機體糖類代謝的需要，提高了ACL基因的表達水平以參與機體的糖類代謝。

ATGL是一種啟動脂肪細胞脂動員的脂肪分解酶，能夠特異性地分解TG（Zimmermann等，2004）。豬、人和鼠的ATGL主要在脂肪組織中表達，是脂肪及其他組織中TG水解起始步驟的限速酶（Shan等，2008；Jenkins等，2004）。ATGL基因表達水平受到日糧、激素等因素的影響。當動物限飼或禁食時，ATGL將TG分解成游離脂肪酸（FFA）以供其他組織利用。Kershaw等（2006）研究指出，限飼可誘導鼠ATGL基因的表達。Villena等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，大鼠限飼12、24 h和48 h，脂肪組織中ATGL表達水平先升高后降低；重新補飼后，ATGL表達水平繼續(xù)下降。本試驗發(fā)現(xiàn)，在早期斷奶仔豬的脂肪組織中，ATGL表達水平顯著升高，與前人的研究結果（Kershaw等，2006）相一致。

4 結論

仔豬在早期斷奶過程中，血清中甘油三酯（TG）、膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）含量降低。同時，肝臟脂類代謝的關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）和固醇調節(jié)元件結合蛋白-1（SREBP-1）基因表達水平均降低，皮下脂肪組織中FAS基因表達水平降低，甘油三酯脂肪酶（ATGL）的基因表達水平升高，反映了仔豬在早期斷奶階段通過調節(jié)肝臟及脂肪組織的脂類代謝關鍵酶相關基因的表達水平動員脂肪，從而為機體提供能量以保證供給平衡。