鐘麗娟， 張慶華

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng)122000）

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人畜爭(zhēng)糧、飼料轉(zhuǎn)化率低、環(huán)境污染等問(wèn)題都已成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，尤其是人們對(duì)食品安全、環(huán)境問(wèn)題的關(guān)注，使得畜牧業(yè)抗生素濫用問(wèn)題的解決刻不容緩，尋找新的抗生素替代品已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)亟待解決的需求。生物飼料為豐富非糧飼料資源、提高飼料轉(zhuǎn)化率、“減抗”“替抗”及緩解環(huán)境污染提供了綜合的解決方案。微生物菌種是生物飼料功能和質(zhì)量的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到產(chǎn)品安全和生物安全性，世界各國(guó)對(duì)此都有明確規(guī)定和嚴(yán)格管理。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料添加劑品種目錄（2008）》中規(guī)定可用于直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑菌種有16種，但對(duì)可飼用微生物資源的開(kāi)發(fā)利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。畜禽腸道內(nèi)分布著與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝緊密相關(guān)的微生物群落，這些微生物更能夠適應(yīng)宿主腸道內(nèi)的生態(tài)環(huán)境，可以協(xié)助宿主分解難以消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。因此，本研究以規(guī)?；B(yǎng)殖的肉雞腸道為來(lái)源，分離篩選可以產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶的微生物菌株，并開(kāi)展生物安全性初步研究，旨在篩選優(yōu)良的飼用微生物菌種資源，為開(kāi)發(fā)更適宜配合玉米-豆粕型飼喂方式的微生物添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理 肉雞樣品來(lái)源于朝陽(yáng)縣柳城鎮(zhèn)木頭溝村養(yǎng)殖小區(qū)，肉雞品種為白羽肉雞AA+，飼養(yǎng)時(shí)間為42 d。將試驗(yàn)肉雞帶回實(shí)驗(yàn)室，用手術(shù)剪刀剪斷頸靜脈處死后，立即剖開(kāi)腹部，按組織學(xué)區(qū)分各腸段，用無(wú)菌棉線結(jié)扎所取各腸段的兩頭，并自結(jié)扎處外端1 cm處剪斷，用酒精棉球消毒各結(jié)扎部位，所剪取的不同組織分裝在無(wú)菌三角瓶中，無(wú)菌塑料膜封口后放入4℃冰箱，備用。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 淀粉培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，瓊脂20 g。羧甲基纖維素鈉CMC-Na培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 5.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，酵母膏0.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。上述培養(yǎng)基分裝至500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，放涼至45℃左右時(shí)，向直徑為90 mm培養(yǎng)皿中加入15 mL培養(yǎng)基，凝固完全后，將平皿倒置于30℃培養(yǎng)箱中去除水汽，備用。

LB斜面培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，分裝至三角瓶，并制備50支試管斜面?zhèn)溆?。LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2。

淀粉酶-液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：豆餅粉4%，玉米粉3%，NaH2PO40.8%，（NH4）2SO40.4%，NH4Cl 0.2%，CaCl20.4%，pH 6.5。纖維素酶-液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：豆餅粉5 g，麩皮20 g，NaH2PO40.4%，（NH4）2SO40.2%，煮沸10 min，pH自然。上述液體培養(yǎng)基分裝至500 mL三角瓶中，裝液量為50 mL，121℃滅菌30 min，備用。

碘染色液：1 g I和2 g KI用蒸餾水定容至300 mL，棕色瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌種初篩 采用稀釋涂平板法，取事先已稱重的滅菌塑料離心管，用鑷子將肉雞盲腸中的內(nèi)容物擠入離心管中，稱重，用無(wú)菌水稀釋至10倍稀釋液備用。取5支含9 mL無(wú)菌水的試管，用移液器將樣品分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋梯度的樣品用移液器分別吸取0.1 mL滴入對(duì)應(yīng)的淀粉培養(yǎng)基平皿中，用刮鏟涂抹均勻，標(biāo)記清楚，每處理3次重復(fù)。將平皿放置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取菌落數(shù)為5～50個(gè)菌落的平板，挑取其中產(chǎn)生透明圈較多，透明圈較為明顯的1塊平板，用記號(hào)筆將產(chǎn)生透明圈的菌落進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記，使用游標(biāo)卡尺分別測(cè)定菌落直徑（I）和透明圈直徑（D），將D/I值大于3.0的菌株進(jìn)行2～3次劃線純化后，轉(zhuǎn)接至LB斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，放置于4℃冰箱保藏。

1.4 菌種復(fù)篩試驗(yàn) 將細(xì)菌斜面菌種分別點(diǎn)接至CMC-Na平板中央，35℃培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定菌落直徑后，將平板中倒入10 mg/mL剛果紅染色液進(jìn)行染色1 h，將平板用1 mol/L NaCl溶液緩慢沖洗，去掉浮色，產(chǎn)纖維素酶活的菌落周邊會(huì)出現(xiàn)透明圈，測(cè)定對(duì)應(yīng)的菌落直徑（I）和透明圈直徑（D）。

1.5 液體產(chǎn)酶能力測(cè)定 將細(xì)菌斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中，35℃、180 r/min培養(yǎng)18 h后，按1%接種量分別接種至兩種液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。35℃、180 r/min，培養(yǎng)40～48 h后，將培養(yǎng)液于4℃、6000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。淀粉酶活力測(cè)定參照食品工業(yè)酶制劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB1886.174-2016的中溫α-淀粉酶測(cè)定方法（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，2016），內(nèi)切型-β-葡聚糖酶（CMC酶）活力測(cè)定參照沈雪亮（2002）等方法進(jìn)行。

1.6 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：采用劃線法將冰箱保藏菌種接種至LB平皿上，培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落特征，采用美蘭染色法，于尼康相差顯微鏡下鏡檢菌體形態(tài)，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（布坎南，1984）和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠，2001）進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

菌株16S rDNA序列分析：用無(wú)菌水將培養(yǎng)48 h的LB斜面試管中的菌體洗下，裝入EP管于-20℃保存?zhèn)溆?。DNA提取使用上海生工生物工程股份有限公司Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行。PCR引物選擇通用引物16S rDNA（7F-1540R和27F-1492R）。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照周宏璐（2010）方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物寄送至上海生工生物工程股份有限公司（上海）進(jìn)行純化與測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.7 安全性試驗(yàn) 試驗(yàn)所用藍(lán)色斑馬魚(yú)來(lái)自上海億諾水族科技有限公司，試驗(yàn)魚(yú)同一批次孵化，體長(zhǎng)約3～5 cm，無(wú)明顯疾病和畸形，試驗(yàn)前每日早晚飼喂2次豐年蝦，感觀飽食，預(yù)飼養(yǎng)15 d后，死亡率為3%，小于5%，符合試驗(yàn)用魚(yú)要求。挑選體長(zhǎng)一致、健康活潑的斑馬魚(yú)進(jìn)行安全性試驗(yàn)。菌液處理：每500 mL三角瓶中裝入200 mL自來(lái)水，121℃滅菌30 min，放置1 d后使用。試驗(yàn)時(shí)于無(wú)菌條件下將LB斜面培養(yǎng)基上的菌體用無(wú)菌水沖下，調(diào)整菌體濃度為2×107cfu/mL和2×109cfu/mL，分別轉(zhuǎn)入500 mL三角瓶中。設(shè)置2個(gè)濃度處理，無(wú)菌水為對(duì)照，每處理5次重復(fù)。試驗(yàn)魚(yú)處理：將全部試驗(yàn)魚(yú)經(jīng)5次無(wú)菌水洗滌，每次200 mL洗滌2 min，每個(gè)三角瓶中放入3條斑馬魚(yú)，操作過(guò)程中要迅速準(zhǔn)確，盡量無(wú)菌操作，飼養(yǎng)周期為30 d，期間記錄斑馬魚(yú)生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果 由表1可知，采用稀釋涂平板法自肉雞盲腸中分離獲得6株在淀粉培養(yǎng)基可水解產(chǎn)生較大透明圈的菌株，其D/I值均大于3.0，具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶活性。將具有產(chǎn)淀粉酶能力的6株細(xì)菌菌株點(diǎn)接至CMC-Na平板測(cè)定菌株產(chǎn)纖維素酶活性，試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株CY-02、CY-03、CY-06具有產(chǎn)纖維素酶能力，其中菌株CY-03產(chǎn)酶活力較強(qiáng)。

表1 菌株篩選結(jié)果

2.2 產(chǎn)酶能力測(cè)定結(jié)果 由表2可知，菌種CY-03的綜合產(chǎn)酶能力較好，培養(yǎng)40 h時(shí)中溫α-淀粉酶活力達(dá)89.47 U/mL，培養(yǎng)48 h時(shí)CMC酶活力可達(dá)65.63 U/mL，表明該菌株具備良好的應(yīng)用價(jià)值。

表2 液體產(chǎn)酶測(cè)定結(jié)果 U/mL

2.3 菌株鑒定結(jié)果 菌株CY-03接種于LB培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)48 h后，菌落呈乳白色，圓形，邊緣波狀，表面干燥，褶皺，不透明，黏液性，菌落較小，直徑為2.0～4.0 mm。鏡檢可見(jiàn)菌體為桿狀，長(zhǎng)約1.15～1.69μm，寬約0.38～0.56μm。芽孢橢圓形或柱狀，端生，長(zhǎng)約0.76～1.0μm，寬約0.45～0.55μm。根據(jù)形態(tài)學(xué)初步判斷該菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌。16S rDNA測(cè)序及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)結(jié)果表明，該菌與Bacillus velezensis屬細(xì)菌的序列同源性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.4 安全性試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，斑馬魚(yú)在菌體濃度為1×107cfu/mL的高濃度菌液中浸浴飼養(yǎng)30 d未出現(xiàn)異常，斑馬魚(yú)生理狀態(tài)仍健康活潑，表明該菌株生物安全性較好，具備較好的應(yīng)用潛力。

表3 菌株CY-03的安全性試驗(yàn)

3 討論

3.1 菌株的篩選與鑒定 生物飼料開(kāi)發(fā)利用的核心技術(shù)在于飼用微生物菌種資源及其菌種功能的深度挖掘。作為一種重要的戰(zhàn)略資源，飼用微生物菌種資源的收集、保藏與評(píng)價(jià)工作至關(guān)重要。在國(guó)內(nèi)外允許使用的飼用微生物資源的基礎(chǔ)上，近年來(lái)更多的關(guān)注放在腸道微生物資源開(kāi)發(fā)利用方面。本試驗(yàn)從肉雞腸道中篩選到多株產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌菌株，其中鑒定1株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），與羅寶龍（2018）、馮光志（2018）、王金燕（2018）等報(bào)道一致。篩選試驗(yàn)表明各產(chǎn)酶菌株在供試的篩選平板上能夠產(chǎn)生明顯的透明圈，該篩選方法適用于細(xì)菌產(chǎn)酶菌株的篩選。

3.2 菌株液體產(chǎn)酶測(cè)定 采用搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行了菌株的液體產(chǎn)酶能力測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)條件為35℃，180 r/min，培養(yǎng)40 h時(shí)中溫α-淀粉酶活力可達(dá)89.47 U/mL，培養(yǎng)48 h時(shí)CMC酶活力可達(dá)65.63 U/mL，搖瓶液體產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，雖然與工業(yè)菌種相比有所差距，但從拓展菌種類型、豐富產(chǎn)品選擇的角度考慮，也具備工業(yè)開(kāi)發(fā)的潛力，后續(xù)將針對(duì)菌種培養(yǎng)及產(chǎn)酶工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

3.3 貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用 研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)，抑制多種植物病原菌，如Bacillus velezensis9912D在2016年已被批準(zhǔn)成為新型殺菌劑，用來(lái)防治茄果類灰霉病、棉花枯萎病、蘋(píng)果樹(shù)腐爛病、晚疫病等植物病害。貝萊斯芽孢桿菌不僅僅存在于土壤中，近年來(lái)越來(lái)越多關(guān)于從動(dòng)物腸道中分離出貝萊斯芽孢桿菌的相關(guān)報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌具有產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶、淀粉酶、蛋白酶等多種產(chǎn)酶特性，又可用于霉菌毒素解毒和飼料基質(zhì)生物修復(fù)，其在食品、動(dòng)物飼料、紡織、造紙、生物燃料、農(nóng)業(yè)廢棄物處理等領(lǐng)域都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值（陳龍，2020）。本試驗(yàn)所篩選到的菌株CY-03具備較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶能力，且對(duì)生物安全性較高，應(yīng)用潛力較大，后續(xù)將對(duì)該菌株的功能和代謝產(chǎn)物類型進(jìn)行更深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)淀粉培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基從AA+白羽肉雞腸道中分離篩選到1株高產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的細(xì)菌菌株CY-03，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

通過(guò)液體產(chǎn)酶試驗(yàn)和生物安全性試驗(yàn)考察菌株的應(yīng)用潛力，結(jié)果表明菌株CY-03具有高產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的特性，液體酶活分別為89.47 U/mL和65.63 U/mL，菌株具備明顯的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。以斑馬魚(yú)為宿主進(jìn)行高濃度菌液飼養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明菌株生物安全性較高，在生物飼料領(lǐng)域具有較好開(kāi)發(fā)潛力。