習(xí)瓚娜， 高 健#， 戴樂軍， 王夢芝*

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009；2.連云港生物工程中等專業(yè)學(xué)校，江蘇連云港222065）

瘤胃微生物的種類多樣，其中細菌和原蟲的生物量較大，細菌占50%～80%、原蟲占20%～50%，是主要的微生物區(qū)系，對宿主的影響也相對更有意義。瘤胃微生物通過厭氧發(fā)酵能夠為宿主提供65%～75%的能量需要，并且瘤胃微生物與反芻動物生產(chǎn)效率緊密相關(guān)（米見對等，2019；Jiang等，2017；Shabat等，2016；Jami等，2014）。因此，對瘤胃微生物區(qū)系的調(diào)控是調(diào)控反芻動物消化代謝和生產(chǎn)的前提。研究發(fā)現(xiàn)，控制原蟲的數(shù)量和組成可提高反芻動物的飼料利用率（王夢芝，2008），同時也可改變小腸氨基酸組成模式（韓春艷等，2002）。在日糧中添加脂肪酸或脂類可影響瘤胃的微生物區(qū)系及其發(fā)酵過程（Potu，2002），進而影響微生物蛋白的合成量（Soltan等，2018）。Abuelfatah等（2016）研究表明，日糧中亞麻籽的兩種添加水平均顯著降低了山羊瘤胃液中原生動物的數(shù)量。盧德勛（2004）對體外培養(yǎng)中多種發(fā)酵指標(biāo)組合效應(yīng)進行評估，提出用多項組合效應(yīng)指數(shù)（MFAEI）將體外發(fā)酵所得的各項指標(biāo)進行綜合量化，以評定不同飼料間的組合效應(yīng)，并利用粗飼料的分級指數(shù)，在最佳粗飼料配方的基礎(chǔ)上優(yōu)化精飼料的配方組合，科學(xué)有效地對反芻動物日糧配方進行系統(tǒng)優(yōu)化（王旭，2003）。綜合平衡法是分析多指標(biāo)正交試驗結(jié)果的分析方法之一（劉瑞江等，2010），其先對各個指標(biāo)分別進行直觀分析，找出其因素水平的最優(yōu)組合，然后根據(jù)各項指標(biāo)重要性及各項指標(biāo)中所得出的因素主次、水平優(yōu)劣等進行綜合平衡，然后對各指標(biāo)的分析結(jié)果進行綜合比較和分析，能夠合理確定各指標(biāo)的權(quán)重，以得出最終優(yōu)化水平 （耿旭等，2018；劉俊娥，2013；劉振學(xué)等，2010）。研究表明，脂肪酸組合能夠調(diào)控瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的發(fā)酵模式（習(xí)瓚娜等，2019），但這些脂肪酸組合對微生物蛋白合成影響的組合效應(yīng)鮮見報道。因此，本試驗通過正交試驗，研究不同脂肪酸組合體外培養(yǎng)對瘤胃微生物蛋白的調(diào)控效果，通過計算MFAEI反映脂肪酸之間的組合效應(yīng)，并利用綜合平衡法分析其最佳調(diào)控組合，為進一步研究脂肪酸對反芻動物瘤胃微生態(tài)機理的影響提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與底物培養(yǎng) 試驗共分10組，其中Ⅰ～Ⅸ組分別添加0.5%、1.0%、1.5%3個水平的硬脂酸、油酸、亞油酸、ɑ-亞麻酸進行正交試驗（硬脂酸、油酸、亞油酸、ɑ-亞麻酸均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司），與基礎(chǔ)培養(yǎng)物（25.50%可溶性淀粉、4.25%木聚糖、4.25%阿拉伯聚糖、4.25%葡聚糖、4.25%甘露聚糖、32.00%纖維素、4.25%果膠、4.25%木質(zhì)素、3.60%尿素、8.40%酪蛋白）混合，并用棕櫚酸鈣平衡能量，每組各設(shè)3個重復(fù)，另外設(shè)1個無底物的空白對照組Ⅹ。L9（34）正交試驗設(shè)計與培養(yǎng)底物的組成參考Abuelfatah等（2016）報道，表1為各組培養(yǎng)底物中脂肪酸的含量。

表1 培養(yǎng)底物中脂肪酸含量%

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理 在揚州大學(xué)現(xiàn)代實驗農(nóng)牧場選取3頭體重相近、體況良好、裝有永久性瘤胃瘺管的健康山羊羯羊作為瘤胃液供體，供體羊采用單欄飼養(yǎng)，飼糧組成為70%羊草、28%玉米、2%豆粕，干物質(zhì)采食量為體重的2.5%，每日07：00和19：00兩次等量飼喂，自由飲水。

1.3 體外培養(yǎng)與樣品采集

1.3.1 瘤胃液的采集 在晨飼前利用自制真空負壓裝置從3頭瘺管羊各采集瘤胃液200 mL，過4層紗布，將過濾后的瘤胃液混合均勻，39℃水浴保溫迅速送回實驗室，即刻參照Menke等（1988）方法準(zhǔn)備體外培養(yǎng)。

1.3.2 取樣設(shè)計 分別在培養(yǎng)后0、3、6、9、12、18、24 h取樣，即刻測定pH并于-20℃冷凍保存，用于培養(yǎng)液NH3-N濃度、微生物蛋白、原蟲蛋白和細菌蛋白的測定。

pH采用上海雷磁試驗設(shè)備廠pHS-3C型pH計進行測定。NH3-N濃度采用馮宗慈（2010）的方法進行。微生物的分離與測定參照王夢芝（2008）的方法進行。

1.4 統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0軟件進行單因子方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan’s法進行多重比較。采用極差分析法，得到最優(yōu)水平。

2 結(jié)果

2.1 脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物pH的影響 由表2可知，隨時間點推移，各試驗組培養(yǎng)液的pH總體呈下降趨勢，并在5.40～7.02之間變化。時間點多重比較發(fā)現(xiàn)，各時間點組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 脂肪酸組合對pH的影響

2.2 脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物NH3-N濃度的影響 由表3可知，隨時間的延長NH3-N濃度呈波動變化，各組的變化不盡一致。氨氮濃度的均值以Ⅳ組最高，為15.53 mg/100 mL；Ⅱ組最低，為11.96 mg/100 mL。在3 h時，Ⅱ組、Ⅷ組和Ⅸ組顯著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組（P＜0.05）。其他各時間點差異不顯著。

表3 脂肪酸組合對NH3-N濃度的影響mg/100 mL

2.3 脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵微生物蛋白含量的影響 由表4可知，微生物蛋白的含量隨采樣時間的延長，總體呈先上升再下降，最后上升的波動變化趨勢，微生物蛋白含量為0.41～2.22 mg/mL時，其24 h均值則以Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ組較高，除Ⅴ組外均高于對照Ⅹ組。時間點多重比較發(fā)現(xiàn)，各時間點各組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 脂肪酸組合對MCP含量的影響mg/mL

由表5可知，極差R為0.27（ɑ-亞麻酸）＞0.16（硬脂酸）＞0.11（亞油酸）＞0.09（油酸），主次順序依次為ɑ-亞麻酸、硬脂酸、亞油酸、油酸。其中0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸對微生物蛋白含量的組合效果最好。

2.4 脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵原蟲蛋白含量的影響 由表6可知，除Ⅴ組外，其他各試驗組均值均高于對照組，其中，原蟲蛋白量Ⅵ組均值最高，為0.92 mg/mL，Ⅴ組均值最低，為0.5 mg/mL。時間點間多重比較發(fā)現(xiàn)，各時間點組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 MCP含量組合分析表（24 h均值）

表6 脂肪酸組合對原蟲蛋白含量的影響mg/mL

由表7可知，極差R為0.23（ɑ-亞麻酸）＞0.16（硬脂酸）＞0.14（亞油酸）＞0.08（油酸），主次順序依次為ɑ-亞麻酸、硬脂酸、亞油酸、油酸。其中0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸對原蟲蛋白含量的組合效果最好。

2.5 脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵細菌蛋白含量的影響 由表8可知，各組中細菌的菌體蛋白總體呈上升趨勢，VII組的平均細菌的蛋白量最高，為0.29 mg/mL；I組細菌蛋白平均值最低，為0.19 mg/mL。并且各組數(shù)據(jù)組間差異不顯著（P＞0.05）。

表7 原蟲蛋白含量組合分析表（24 h均值）

表8 脂肪酸組合對細菌蛋白含量的影響mg/mL

由表9可知，極差R為0.04（ɑ-亞麻酸）＞0.03（油酸）=0.03（亞油酸）＞0.01（硬脂酸），主次順序依次為ɑ-亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸。其中0.5%或1.0%硬脂酸、1.5%油酸、1.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸對細菌蛋白含量的組合效果最好。

2.6 組合效應(yīng)綜合評定指數(shù)結(jié)果 由表10 MFAEI結(jié)果顯示，除Ⅴ組外，其他添加不同濃度脂肪酸組合后發(fā)生了明顯的正效應(yīng)，產(chǎn)生正組合效應(yīng)，其中以Ⅵ組最優(yōu)（MAFEI=0.77）。

表9 細菌蛋白含量組合分析表（24h均值）

由表11可知，極差R為0.65（ɑ-亞麻酸）＞0.42（硬脂酸）＞0.32（油酸）＞0.20（亞油酸），主次順序依次為ɑ-亞麻酸、硬脂酸、油酸、亞油酸。其中1.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸的組合效果最好。

2.7 綜合平衡法分析 經(jīng)綜合平衡法分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸時，對瘤胃發(fā)酵和瘤胃原蟲、細菌蛋白等的組合效應(yīng)最好

3 討論

3.1 不同脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 pH可反映瘤胃發(fā)酵狀況，關(guān)于本試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)液pH在5.40～7.02，適于瘤胃微生物的正常生長。體外培養(yǎng)瘤胃微生物，Ivan等（2013）研究表明，亞麻籽對瘤胃pH沒有影響；Ebrahimi等（2017）發(fā)現(xiàn)，日糧中n-3：n-6脂肪酸的比例對山羊瘤胃pH無影響；Atikah等（2018）也發(fā)現(xiàn)，飼喂含不同脂肪酸的食用油對山羊瘤胃pH無顯著影響。對添加3%的不同脂肪酸體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，pH差異也不顯著（皮宇等，2014），這與本試驗結(jié)果一致。這表明脂肪酸組合對瘤胃微生物pH無明顯影響。氨能為瘤胃微生物生長提供氮源，是MCP合成的底物，氨氮濃度在一定程度上能表明微生物活力的強弱。Ortega等（1979）研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中NH3-N的最佳濃度為6.3～27.5 mg/100 mL。本試驗中，氨氮濃度為11.96～15.53 mg/100 mL，適于瘤胃微生物的正常生長代謝，并且不同脂肪酸組合的體外培養(yǎng)對瘤胃NH3-N濃度無影響，這與其他試驗結(jié)果相同（Atikah等，2018；Ebrahimi等，2017；皮宇等，2014）。

表10 組合效應(yīng)綜合評定指數(shù)結(jié)果%

表11 綜合效應(yīng)組合分析表（24 h均值）%

表12 綜合平衡法分析%

3.2 不同脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃微生物蛋白的影響 原蟲和細菌是主要的微生物區(qū)系，其生物量的高低關(guān)系著瘤胃發(fā)酵效果與宿主的消化代謝。不飽和C18脂肪酸能夠改變瘤胃發(fā)酵模式和微生物種群分布（Zhang等，2008）。許多研究表明，日糧中添加脂肪酸能抑制瘤胃中原蟲和部分菌群的生長，使微生物總量和活力改變，增加微生物蛋白的合成，從而引起瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，進而影響瘤胃的發(fā)酵（Fiorentini等，2014；Messana等，2013；Liu等，2011；王夢芝等，2010；Maia等，2010）。不飽和長鏈脂肪酸對原蟲和細菌均有不同程度的抑制作用，且其對原蟲的抑制效應(yīng)隨不飽和度的增加而增加，使得原蟲生物量降低，進而抑制原蟲吞噬細菌，改變瘤胃微生物區(qū)系（Ivan等，2013）。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組的MCP、原蟲蛋白、細菌蛋白在組間均無顯著差異。與本結(jié)果一致的是，精油組合對瘤胃液微生物蛋白的產(chǎn)生和原生動物數(shù)量沒有影響（Newbold等，2004）；在日糧中添加3%大豆油或2%向日葵油與1%魚油的混合添加也對微生物蛋白質(zhì)合成沒有影響（Vargas等，2017；Potu等，2011）。楊舒黎（2007）研究發(fā)現(xiàn)，豆油與胡麻油組合后比兩種油單獨添加時對瘤胃微生物的效果好，亞油酸緩解了亞麻酸對微生物的抑制作用。而本試驗結(jié)果則可能是脂肪酸的混合添加有效改善了單一脂肪酸對微生物的抑制效應(yīng)，從而降低了脂肪酸對瘤胃微生物的抑制程度。同時，這也證明了不同脂肪酸的混合添加比單一脂肪酸的添加更能有效改善脂肪對瘤胃發(fā)酵的影響（Jenkins，2008），這一定程度說明不同脂肪酸組合存在一定的組合效應(yīng)。張一帆等（2019）采用體外產(chǎn)氣法分析累積產(chǎn)氣量和不同組合pH、干物質(zhì)降解率（DMD）及MCP、NH3-N、VFA含量變化，計算SMAEI和MFAEI，根據(jù)MFAEI得出玉米秸稈青貯∶羊草∶燕麥草∶精飼料最優(yōu)組合比例為10∶15∶25∶50。羅陽等（2018）通過測定體外瘤胃發(fā)酵的累積產(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸VFA、NH3-N、MCP和體外有機物消化率（IVDOM），計算MFAEI以綜合評價桑葉和羊草的組合效應(yīng)，從而得出桑葉和羊草能夠改善體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)，其中最佳比例為60：40。楊洪明等 （2019）采用MFAEI，通過體外培養(yǎng)法測定培養(yǎng)液pH、體外產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)消化率、體外中心洗滌纖維（NDF）消化率，以綜合評價不同GI指數(shù)的粗飼料和精飼料之間的組合效應(yīng)，從而得出粗飼料之間玉米青貯和羊草的組合最為理想。本試驗中，研究不同脂肪酸的組合效應(yīng)對瘤胃微生物合成的調(diào)控作用，由于MCP、原蟲蛋白、細菌蛋白與微生物合成密切相關(guān)，因此本試驗中綜合考慮這幾個指標(biāo)進行MFAEI分析。試驗結(jié)果表明，添加不同濃度脂肪酸組合之間產(chǎn)生了正組合效應(yīng)。

綜合平衡法是分析多指標(biāo)正交試驗結(jié)果的分析方法之一（劉瑞江等，2010）。Ye等（2014）通過正交試驗優(yōu)化富含甘油酵母培養(yǎng)物的制備及其對山羊血液代謝和瘤胃發(fā)酵的影響，通過優(yōu)化不同的葡萄糖濃度、氮源、尿素濃度、磷源、玉米漿干粉濃度和NaCl濃度，使甘油產(chǎn)量和總生物量達到最大，最終確定富含甘油的酵母培養(yǎng)物包含（38.7±0.6）g/L甘油和（12.6±0.5）g/L生物質(zhì)。戚如鑫等（2019）運用綜合平衡法分析稻草秸稈與白菜尾菜混合青貯對養(yǎng)分變化的影響，通過對干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分、可溶性碳水化合物的綜合比較與分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)静萁斩捄桶撞宋膊速|(zhì)量比為4：6、植物乳桿菌添加量為0.030 g/kg、纖維素酶添加量為0.25 g/kg時，有利于提升稻草秸稈與白菜尾菜混合青貯的養(yǎng)分。祿璐等（2018）采用綜合平衡法研究影響噴霧干燥工藝制備枸杞鮮顆粒沖劑的各因素，確定了最佳工藝組合為進風(fēng)溫度140℃，給氣量85%，進料速度28 mL/min，此條件下獲得的枸杞鮮顆粒沖劑中枸杞多糖達4.05%，黃酮含量為0.081%，功效成分保持最好。本文通過對各個單指標(biāo)（微生物蛋白、原蟲蛋白、細菌蛋白及MFAEI）進行分析，然后對各個指標(biāo)的分析結(jié)果進行綜合比較發(fā)現(xiàn)，添加0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸時，對瘤胃發(fā)酵和瘤胃原蟲、細菌蛋白等的組合效應(yīng)最好。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，這四種脂肪酸不同組合的體外培養(yǎng)對微生物蛋白、原蟲蛋白、細菌蛋白影響的主次順序中ɑ-亞麻酸都排在了第一位，說明在脂肪酸組合中，ɑ-亞麻酸對瘤胃微生物的影響起主導(dǎo)作用。這與Wang等（2019）和皮宇等（2014）發(fā)現(xiàn)ɑ-亞麻酸對瘤胃微生物的調(diào)控作用更大的結(jié)果一致，也再一次驗證了不飽和長鏈脂肪酸對原蟲的負作用隨不飽和度的增加而增加（Ivan等，2013）。張娟（2019）發(fā)現(xiàn)，不同比例亞麻油與棕櫚油的混合添加對絨山羊瘤胃內(nèi)總細菌數(shù)量無顯著影響，但會抑制部分細菌數(shù)量。這啟示在接下來的試驗中，還應(yīng)該通過檢查特定細菌種類來確定添加脂肪酸對瘤胃細菌的影響。

4 結(jié)論

脂肪酸組合對瘤胃微生物蛋白有一定的調(diào)控作用。綜合平衡法分析發(fā)現(xiàn)，在本試驗條件下，添加0.5%硬脂酸、1.5%油酸、0.5%亞油酸、1.0%ɑ-亞麻酸時，對瘤胃發(fā)酵和瘤胃原蟲、細菌蛋白的組合效應(yīng)最好。