陳光耀，陳嘉琪，姚傳輝，徐 愿，羅 靜，鄢澤然，陶慶文

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京100029；2.中日友好醫(yī)院中醫(yī)風濕病科，免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京100029）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節(jié)軟骨退變、骨贅形成及軟骨下骨硬化為特征的退行性病變［1］。研究表明OA與年齡、肥胖及關節(jié)創(chuàng)傷等一系列因素關系密切［2，3］。目前，越來越多證據(jù)表明炎癥反應與骨關節(jié)炎的發(fā)生及長期存在有密切關系，尤其在OA早期，軟骨細胞及滑膜細胞分泌的相關炎性細胞因子發(fā)揮了至關重要的作用［4，5］。軟骨細胞在白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子的刺激下，通過PI3K/AKT、MAPK及NF-κB等途徑刺激分泌OA相關的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），并進一步造成軟骨基質降解是軟骨退變發(fā)生的重要因素［6，7］。

SW1353細胞最初由美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）從一名原發(fā)軟骨肉瘤患者肱骨處提取，該細胞系在保留了相關軟骨細胞特性的同時能夠無限增殖。研究表明，該細胞與人的軟骨細胞均能夠被炎性因子誘導產生MMPs，因此廣泛用于OA相關研究［8］。地塞米松（DEX）屬于甾體類抗炎藥物，可抑制前列腺素等花生四烯酸代謝產物，同時促進黏多糖合成并抑制其降解酶從而發(fā)揮保護細胞間基質的作用，在臨床中廣泛用于自身免疫性炎癥性疾病、過敏性疾病的治療［9，10］。本研究擬通過地塞米松干預IL-1β致炎的SW1353 OA細胞模型，探究地塞米松潛在的軟骨保護作用，為通過關節(jié)腔注射甾體抗炎藥預防OA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

SW1353細胞（ATCC來源）購買于北京中科質檢生物技術有限公司。其他試劑有：Leibovitiz′s L-15培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（ScienCell，美國），地塞米松（Sigma，美國），［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfo -phenyl）-2H-tetrazolium inner salt，MTS］（Promga，美國），IL-1β（Peprotech，美國），磷酸緩沖鹽溶液（Hyclone，美國），MMP-1抗體（10371-2-AP，Proteintech,美國），MMP-3抗體（ab53015，Abcam，英國），MMP-13抗體（ab39012，Abcam，英國），小鼠抗β-actin抗體（TA-09，中杉金橋，中國），山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記（ZB-5305，中杉金橋，中國），山羊抗兔IgG/辣根酶標記（ZB-2301，中杉金橋，中國），10%變性預制膠（普利萊，中國），膜封閉液（索萊寶，中國），一抗二抗稀釋液（普利萊，中國），PVDF膜（Millipore，美國），ECL發(fā)光液（Millipore，美國），逆 轉 錄 試 劑 盒（A 3500，Promga，美 國），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，TOYOBO，日本），Ripa裂解液（索萊寶，中國），PMSF（索萊寶，中國），HiPure Total RNA Mini Kit（美基公司，中國），MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-actin引物（擎科生物科技），具體序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences of PCR

1.2 細胞培養(yǎng)

SW1353于含90%L-15培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100μ/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，密閉瓶口放置于37℃孵箱中，待細胞長滿培養(yǎng)瓶后使用胰酶將細胞消化后收集細胞。細胞增殖實驗時將細胞種植于96孔板并設置4個副孔（每孔2萬個細胞），PCR及Western Blot實驗將細胞種植于6孔板中（每孔50萬個細胞），給予不同濃度地塞米松和（或）10 ng/mL IL-1β進行干預，干預后使用封口膜封閉培養(yǎng)板。

1.2 MTS法檢測地塞米松、IL-1β對SW1353細胞活性的影響

將收集到的未干預細胞加入完全培養(yǎng)基稀釋成20萬個細胞/mL，充分混勻后將96孔板每孔加入100μL含細胞培養(yǎng)基，分別加入地塞米松溶液使培養(yǎng)基中地塞米松最終濃度為101～108nmol/L，未加地塞米松溶液組別作為空白對照組，使用封口膜封閉96孔板于37℃孵箱中培養(yǎng)12 h，每孔加入20μL MTS，1 h后將96孔板置于酶標儀中檢測490 nm波長下的光密度值。將空白對照組細胞活力設定為100%，并以此為基礎計算其余各組細胞活力。104、106、107nmol/L地塞米松組加入或不加入10 ng/mL IL-1β，計算各組細胞活力并與空白對照組比較。

1.3 實時定量PCR法檢測MMP-1、MMP-3、MMP-13的mRNA表達

將收集到的細胞加入完全培養(yǎng)基稀釋成25萬個細胞/mL，充分混勻后6孔板每孔加入2 mL含細胞培養(yǎng)基。取不做特殊處理的組別作為空白對照組，其余各組均加入10 ng/mL IL-1β。IL-1β組不加地塞米松，其余各組分別加入地塞米松，使溶液中 地 塞 米 松 最 終 濃 度 分 別 為101、102、103、104、105、106、107nmol/L，使用封口膜封閉6孔板于37℃孵箱中培養(yǎng)12 h，采用HiPure Total RNA Mini Kit試劑盒進行柱式法提取總RN，并進一步將1μg總RNA逆轉錄形成cDNA，將SYBR Green Realtime PCR Master Mix、cDNA及引物配置成20μL反應體 系，以β-actin作 為 內 參 檢 測MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量。

1.4 Western Blot法 檢 測MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表達

實驗分組及干預方法同PCR實驗，干預結束后將1%PMSF加入Ripa裂解液中，棄去培養(yǎng)基后每孔加入Ripa裂解液250μL于冰上裂解25 min，10 000 r/min離心5 min取上清液。將上清液與上樣緩沖液以4∶1的比例進行混合，煮沸后離心10 000 r/min離心5 min，取上清液上樣。使用10%變性預制膠及自帶Hepes電泳緩沖液進行電泳，使用70 v電壓進行60 min轉膜至PVDF膜上，膜封閉液進行封閉1 h后，加入相應稀釋后的一抗（MMP-1 1∶5 000、MMP-3 1∶1 000、MMP-13 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）后4℃進行過夜，使用TBST進行清洗后加入相應的稀釋后的山羊抗小鼠（兔）IgG/辣根酶標記二抗（1∶5 000）孵育1 h，使用TBST清洗后滴加ECL發(fā)光液后進行曝光。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不同濃度地塞米松組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTS法檢測地塞米松對SW1353細胞的抑制作用

MTS增殖實驗結果提示101～107nmol/L地塞米松對細胞活性無明顯影響，108nmol/L地塞米松對細胞具有明顯的抑制作用（圖1、表2）；在0、104、106、107nmol/L不同濃度地塞米松干預下，加入或不加入10 ng/mL IL-1β對其細胞活性未見明顯影響（圖2、表3）。因此，本研究選擇地塞米松濃度為101～107nmol/L作為后續(xù)實驗工作濃度。

2.2 PCR法 檢 測MMP-1、MMP-3、MMP-13的mRNA表達

當SW1353細胞加入10 ng/mL的IL-1β后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的表達水平明顯升高（6～14倍）。PCR結果提示使用不同濃度的地塞米松干預IL-1β誘導的SW1353細胞后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的表達水平有所降低，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應。如圖3、表4所示，加入102～107nmol/L地塞米松進行干預后，MMP-1的mRNA表達水平明顯降低，和僅加入IL-1β組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；104～107nmol/L地塞米松干預后，MMP-3的mRNA表達明顯減少，和僅加入IL-1β組相比差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；101～107nmol/L地塞米松干預后，MMP-13的mRNA表達明顯減少，和僅加入IL-1β組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。加入104nmol/L地塞米松組與加入103nmol/L地塞米松組相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達水平明顯降低，推測該濃度的地塞米松可能是適宜于 干預IL-1β誘導的SW1353細胞的最適宜濃度。

圖1 不同濃度地塞米松干預SW1353細胞12 h后細胞活力Fig 1 Cell viability of SW 1353 cells 12 h after treatment of dexamethasone at different concentrations

圖2 加入或不加入IL-1β不同濃度地塞米松培養(yǎng)SW1353細胞12 h細胞活力Fig 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of dexamethasone with or without IL-1β

表2 101～108 nmol/L地塞米松培養(yǎng)SW1353細胞12 h后細胞活力（±s）Tab 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～108 nmol/L dexamethasone（±s）

表2 101～108 nmol/L地塞米松培養(yǎng)SW1353細胞12 h后細胞活力（±s）Tab 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～108 nmol/L dexamethasone（±s）

注：q：Dunnett檢驗統(tǒng)計量。#不同濃度地塞米松（DEX）組分別與空白對照組比較。

指標細胞活力q P#空白對照組100.00±9.29 101 DEX 102 DEX 103 DEX 104 DEX 105 DEX 106 DEX 107 DEX 108 DEX 69.18±10.04 4.49 0.001--101.21±10.48 0.18 1.000 101.93±13.81 0.28 1.000 101.88±12.98 0.27 1.000 101.80±4.06 0.26 1.000 98.40±5.27 0.23 1.000 100.96±7.76 0.14 1.000 99.16±9.48 0.12 1.000

表3 加入或不加入IL-1β不同濃度地塞米松（101～107 nmol/L）培養(yǎng)SW1353細胞12 h細胞活力（±s）Tab 3 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～107 nmol/L dexamethasone with or without 10 ng/m L IL-1β（±s）

表3 加入或不加入IL-1β不同濃度地塞米松（101～107 nmol/L）培養(yǎng)SW1353細胞12 h細胞活力（±s）Tab 3 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～107 nmol/L dexamethasone with or without 10 ng/m L IL-1β（±s）

注：△加入10 ng/m L IL-1β干預，q：Dunnett檢驗統(tǒng)計量，#不同濃度地塞米松（DEX）組分別與空白對照組比較。

指標空白對照組IL-1β組104 DEX 104△DEX 106 DEX 106△DEX 107 DEX 107△DEX細胞活力100.00±9.29 101.86±7.36 101.80±4.06 97.3±12.88 99.16±9.48 103.34±6.73 69.18±10.04 68.62±3.37 5.26 0.000 q P#--0.31 1.000 0.30 1.000 0.45 0.997 0.14 1.000 0.56 0.991 5.16 0.000

圖3 101～107 nmol/L地塞米松干預IL-1β誘導后的SW1353細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達水平（n=3）Fig 3 Expression level of MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA of SW1353 cells treated with 101-107 nmol/L dexamethasone and 10 ng/m L IL-1β（n=3）

表4 101～107nmol/L地塞米松溶液干預IL-1β刺激后的SW1353細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA表達（±s）Tab4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13mRNAof10ng/mLIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith101-107nmol/L dexamethasone（±s）

表4 101～107nmol/L地塞米松溶液干預IL-1β刺激后的SW1353細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA表達（±s）Tab4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13mRNAof10ng/mLIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith101-107nmol/L dexamethasone（±s）

注：*q為Dunnett檢驗統(tǒng)計量，☆白介素-1β（IL-1β）組與空白對照組采用t檢驗。#不同濃度地塞米松（DEX）組分別與IL-1β組進行比較。

指標MMP-1mRNA q P#ˉMMP-3mRNA q P#MMP-13mRNA q P#107DEX 1.70±0.35 13.42 0.000 4.20±0.57 11.08 0.000 1.18±0.14 18.10 0.000空白對照組1.00±0.00--1.00±0.00--1.00±0.00--IL-1β組7.28±0.79 13.79☆0.005 12.63±0.89 22.75☆0.002 13.10±1.53 13.70☆0.005 101DEX 6.62±0.72 1.57 0.486 11.25±1.23 1.81 0.347 9.57±1.12 5.35 0.000 102DEX 5.69±0.62 3.82 0.008 12.26±1.34 0.49 0.996 9.16±1.07 5.98 0.000 103DEX 4.99±0.54 5.51 0.000 10.77±1.18 2.45 0.122 6.26±0.62 10.38 0.000 104DEX 2.19±0.24 12.22 0.000 6.25±0.69 8.37 0.000 1.84±0.22 17.09 0.000 105DEX 1.96±0.21 12.79 0.000 5.78±0.63 9.00 0.000 1.63±0.14 17.41 0.000 106DEX 1.80±0.20 13.16 0.000 4.57±0.50 10.59 0.000 1.55±0.08 17.53 0.000

2.3 Westernblot法 檢 測MMP-1、MMP-3、MMP-13的蛋白表達水平

Westernblot結果顯示，相對于空白對照組，使用10ng/mLIL-1β刺激后，SW1353細胞MMP-1、MMP-3、MMP-1水平明顯增高；使用104nmol/L的地塞米松干預后，和僅添加IL-1β組SW1353細胞比，MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表達水平明顯降低。見表5，圖4、5。

表5 104nmol/L地塞米松溶干預IL-1β刺激后的SW1353細胞后MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表達westernblot灰度值（±s）Tab5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinof IL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone（±s）

表5 104nmol/L地塞米松溶干預IL-1β刺激后的SW1353細胞后MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表達westernblot灰度值（±s）Tab5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinof IL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone（±s）

注：#白介素-1β（IL-1β）組和空白對照組比較，DEX（地塞米松）組和IL-1β組比較。

指標MMP-1蛋白t P#MMP-3蛋白t P#MMP-13蛋白t P#空白對照組1.00±0.00--104DEX 3.533±0.57 2.92 0.043 1.24±0.07 8.91 0.001 1.50±0.21 3.98 0.016 1.00±0.00--1.00±0.00--IL-1β組5.267±0.86 8.62 0.013 2.74±0.28 10.62 0.009 2.94±0.59 5.68 0.030

圖4 104nmol/L的地塞米松干預IL-1β誘導SW1353細胞后MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表達水平Fig4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13proteinsofSW1353cellstreatedwith104nmol/LdexamethasoneandIL-1β

圖5 104nmol/L地塞米松溶干預IL-1β誘導SW1353細胞后MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表達westernblot灰度值Fig5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinofIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone

3 討論

活細胞中產生的還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，能夠將MTS還原為有色的甲臢，通過檢測其在490 nm的背景吸光度值可間接反映出活細胞數(shù)量［11］。本研究通過MTS實驗發(fā)現(xiàn)，101～107nmol/L地塞米松對SW1353細胞活性未見明顯的影響，當?shù)厝姿蓾舛仍黾拥?08nmol/L后細胞活性明顯被抑制，故本研究將地塞米松實驗濃度設定在101～107nmol/L。

細胞外基質與細胞之間存在相互作用并對組織結構進行支持，因此在機體生理過程中發(fā)揮重要作用［12，13］。軟骨由少量軟骨細胞及大量細胞外基質構成，在相關蛋白酶的催化作用下，細胞外基質平衡被打破導致軟骨被降解是OA發(fā)生的關鍵因素［14，15］。MMPs依賴Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子進行活化，與細胞外基質降解有密切關聯(lián)，其中膠原酶MMP-1、MMP-13及基質溶解素酶MMP-3與OA關系最為密切［16-18］。本研究表明SW1353細 胞 被IL-1β誘 導 后，MMP-1、MMP-3、MMP-13在mRNA及蛋白表達水平均明顯上升，與之前研究結果一致。

在使用不同濃度地塞米松進行干預后發(fā)現(xiàn)，較低濃度的地塞米松（MMP-13 10 nmol/L、MMP-1 100 nmol/L、MMP-3 1 000 nmol/L）即可對MMP具有一定的抑制作用，且具有明顯的劑量-效應關系。其中使用104nmol/L地塞米松進行干預后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的 表 達 量 較10、102、103nmol/L地塞米松干預后明顯降低，結合105～107nmol/L地塞米松實驗結果推測在本實驗中104nmol/L濃度的地塞米松可能是達到較大抑制MMPs mRNA表達效果的最小劑量。進一步使用104nmol/L濃度的地塞米松對MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA蛋白水平的干預作用進行探究，Western blot實驗結果提示，該濃度的地塞米松可以明顯抑制MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA在蛋白水平的表達。

關節(jié)外傷及類風濕關節(jié)炎患者滑膜等組織產生IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子［19，20］，進入關節(jié)腔后可以誘導軟骨細胞產生MMP-1、MMP-3、MMP-13，從而導致軟骨基質平衡破壞，進而造成OA的發(fā)生。本研究結果提示，小劑量的地塞米松即可延緩這些炎癥反應的發(fā)生。推測在炎癥反應初期進行小劑量的甾體抗炎藥注射或可有效阻止OA的進展，但需動物實驗及臨床研究進一步驗證。

本試驗通過IL-1β致炎SW1353細胞制造OA細胞模型，并使用PCR、Western Blot方法檢測地塞米松干預造模細胞后基質金屬蛋白酶的變化，探索了地塞米松潛在的軟骨保護作用。本文未對與骨關節(jié)炎相關的其他細胞因子進行檢測，也未能更進一步地通過通路探索地塞米松抑制MMPs的具體機制。