張德蓮，蔡昕添，曹媛媛，洪 靜，朱 晴，吳 婷，李南方

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療研究中心，新疆高血壓研究所，國家衛(wèi)生健康委員會高血壓診療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830000）

腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤，具有極低的發(fā)病率和極高的死亡率［1］。在北美和中歐地區(qū)，成人ACC的年發(fā)病率為每百萬人0.7～2.0例，發(fā)病年齡主要集中在40～60歲［2］。ACC惡性程度極高，其中位總體生存期為3～4年。完全手術(shù)切除腫瘤是ACC的主要治療手段［3］。然而，即便是I期腫瘤，切除后累積復(fù)發(fā)率仍然很高（30%～75%），且中、晚期患者往往已喪失手術(shù)指征。目前對于無法進(jìn)行手術(shù)的ACC患者，指南多建議使用米諾坦和/或鉑類聯(lián)合化療的方式進(jìn)行全身治療，但此方案對患者5年生存率的改善較為有限，尚存較多爭議。除此之外，由于ACC是一種罕見的腫瘤，成人的ACC尤其難以診斷［4，5］。

在過去的十年里，基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠在泛基因組水平上研究多種類型癌癥的基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)改變。生物信息學(xué)分析方法的迅速發(fā)展為基因組學(xué)結(jié)果的解讀帶來了全新的思路。本研究通過利用在線生物信息學(xué)分析工具GEPIA、UALCAN和GEO數(shù)據(jù)庫檢索獲得的基因芯片篩選并驗(yàn)證了ACC診斷和預(yù)后的關(guān)鍵基因，以期為進(jìn)一步探討ACC發(fā)生、發(fā)展的遺傳分子機(jī)制和發(fā)掘治療潛在靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源包括GEPIA數(shù)據(jù)平臺［6］、GEO數(shù)據(jù)庫［7］及UALCAN數(shù)據(jù)平臺［8］。其中GEPIA數(shù)據(jù)平臺包含77例ACC患者和128例健康成年人的腎上腺皮質(zhì)組織測序數(shù)據(jù)；來源于GEO數(shù)據(jù)庫的GSE33371芯 片［9］［GPL 570（HG-U133_Plus_2）Affymetrix Human Genome U 133 Plus 2.0 Array］中包含33例腎上腺皮質(zhì)癌、22例腎上腺皮質(zhì)腺瘤和10例正常成人腎上腺皮質(zhì)的組織測序數(shù)據(jù)；UALCAN數(shù)據(jù)平臺包含79例ACC患者的腎上腺皮質(zhì)組織測序數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選 使用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的在線分析工具對77例ACC患者和128例正常腎上腺皮質(zhì)組織的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。使用limma法進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)包括：|Log2FC|Cutoff≥2、Q-value Cutoff＜0.01。

1.2.2 生存相關(guān)基因的篩選 利用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的在線分析工具分別采用總生存率與無病生存率的方法對差異表達(dá)基因進(jìn)行批量生存分析，分別獲得兩種方法計(jì)算所得HR值排名前100個基因。采用韋恩圖取交集的方法最終獲得對總生存率與無病生存率均發(fā)揮關(guān)鍵作用的核心基因。

1.2.3 生存相關(guān)基因與病理分期的關(guān)系 利用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的“Pathological Stage Plot”在線分析功能探究上述生存最相關(guān)基因與ACC病理分期的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單向方差分析，P＜0.05則視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 生存相關(guān)基因的驗(yàn)證 利用UALCAN數(shù)據(jù)分析平臺對上述篩選獲得的生存相關(guān)基因進(jìn)行再次驗(yàn)證并繪制Kaplan-Meier生存曲線，分析上述篩選獲得的生存相關(guān)基因表達(dá)高低與ACC預(yù)后間的關(guān)系。

1.2.5 生存相關(guān)基因診斷價值的評價 本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫的GSE33371芯片數(shù)據(jù)集對上述生存相關(guān)基因的診斷價值進(jìn)行了評價。本分析利用R語言（3.6.3版）中的pROC包繪制ROC曲線并通過計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）來評價每一個生存相關(guān)基因的診斷性能。當(dāng)AUC值大于0.7時，可視為該基因具有優(yōu)良的診斷性能。

2 結(jié)果

2.1 ACC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)DEGs篩選的結(jié)果

采用limma法進(jìn)行差異表達(dá)分析，最終獲得514個差異表達(dá)的基因。其中94個基因在ACC中低表達(dá)，420個基因高表達(dá)，差異表達(dá)基因與染色體的關(guān)系見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因及其染色體分布圖Fig 1 Differentially expressed genes and their chromosomal distribution

2.2 生存相關(guān)基因的篩選

利用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的在線分析工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行批量生存分析，分別獲得與總生存率與無病生存率最相關(guān)的前100個基因。采用韋恩圖取交集的方法最終獲得對總生存率與無病生存率均發(fā)揮關(guān)鍵作用的13個核心基因，見圖2。上述13個核心基 因包括：TP73、SNHG1、PDE6D、GPC2、SUV39H2、HELLS、CLK2、COPS7B、CEP164、SS18、RGL2、TET1。

2.3 生存相關(guān)基因與病理分期的關(guān)系

利用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的在線分析功能探究上述生存相關(guān)基因與ACC病理分期的關(guān)系。上述基因表達(dá)水平與ACC病理分期之間關(guān)系見圖3。其 中TP73、SNHG1、PDE6D、GPC2、SUV 39H 2、HELLS、CLK 2、COPS7B和CEP164基因的表達(dá)水平與ACC病理分期間的關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而SS18、RGL 2和TET 1基因與ACC病理分期之間不存在顯著關(guān)系。

2.4 生存相關(guān)基因的驗(yàn)證

圖2 韋恩圖Fig 2 Venn diagram

利用UALCAN數(shù)據(jù)分析平臺對TP73、SNHG1、PDE6D、GPC2、SUV 39H 2、HELLS、CLK 2、COPS7B和CEP164基因的表達(dá)水平與ACC患者生存率間的關(guān)系進(jìn)行再次驗(yàn)證并繪制Kaplan-Meier生存曲線。UALCAN數(shù)據(jù)分析結(jié)果再次證實(shí)TP73、SNHG1、PDE6D、GPC2、SUV 39H 2、HELLS、CLK 2、COPS7B和CEP164基因的高表達(dá)組與低表 達(dá)組間生存狀況存在顯著差異，見圖4。

圖3 基因表達(dá)水平與病理分期關(guān)系的小提琴圖Fig 3 Violin plot of relationship between gene expression level and pathological stage

圖4 ACC生存相關(guān)核心基因的Kaplan-Meier生存曲線圖Fig 4 Kaplan-Meier survival curve of ACC survival-related core genes

2.5 生存相關(guān)基因診斷價值的評價

為探究上述9個生存相關(guān)核心基因的對ACC患者與非ACC患者的區(qū)分能力，本研究利用GSE33371芯片數(shù)據(jù)集對上述核心基因進(jìn)行了ROC分析。ROC分析結(jié)果顯示HELLS基因（AUC=0.961）、COPS7B基因（AUC=0.943）、TP73基因（AUC=0.933）、PDE6D基 因（AUC=0.916）、CLK 2基因（AUC=0.896）、CEP164基因（AUC=0.873）、SUV 39H 2基因（AUC=0.852）、SNHG1基因（AUC=0.771）和GPC2基 因（AUC=0.750）AUC值均＞0.7，提示上述基因在ACC診斷中具有較好的鑒別價值，見圖5。

圖5 9個生存相關(guān)基因鑒別ACC的ROC曲線Fig 5 ROC of 9 survival related genes for identification of ACC

3 討論

大量流行病學(xué)研究表明腎上腺腫瘤是一類較為常見的腫瘤，大多為良性、無功能的腎上腺皮質(zhì)腺瘤。然而腎上腺皮質(zhì)癌卻是一種極其罕見的惡性腫瘤［10］。由于ACC的罕見性和復(fù)雜多變的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致其早期診斷極其困難［11］。此外，ACC具有侵襲性極強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。故準(zhǔn)確評估患者預(yù)后、及時給予有效治療對改善患者生存情況具有至關(guān)重要的意義。本研究從基因組學(xué)數(shù)據(jù)入手，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，尋找ACC潛在的診斷、預(yù)后標(biāo)記物，探索新的治療靶點(diǎn)，以便積極、有效地改善患者預(yù)后。

TP73基因是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其編碼蛋白質(zhì)屬于p53腫瘤抑制蛋白家族成員，因此TP73基因與p53基因具極強(qiáng)的同源性［12］。人TP73基因可通過選擇性剪接和/或使用選擇性啟動子而產(chǎn)生蛋白質(zhì)的不同亞型或轉(zhuǎn)錄變體［13］。TP73轉(zhuǎn)錄變體有兩種主要形式，即具有轉(zhuǎn)錄活性的TAp73和非活性的DNp73亞型，其中含有反式激活結(jié)構(gòu)域的亞型是促凋亡的，而氨基末端截短的DNp73則是一個抗凋亡基因，其氨基末端截短也阻斷了p53和反式激活p73亞型的功能［14］。由于DNp73的作用超過了全段TAp73的積極作用，因此它在癌癥發(fā)病中具有決定性的作用［13，15］。有研究指出，TP73在許多癌癥的預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用，DNp73與TAp73的失衡是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和對化療耐藥的重要因素［15］。SUV 39H 2基因也是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其主要編碼產(chǎn)物為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶［16］。盡管SUV 39H 2編碼蛋白質(zhì)被確定為一種胚胎特異性蛋白質(zhì)，并僅產(chǎn)生于健康成年人的睪丸之中，但它在諸如白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和肝細(xì)胞癌等癌癥組織中普遍過表達(dá)［17］。越來越多的證據(jù)表明SUV 39H2基因通過啟動子三甲基化等過程促進(jìn)癌變形成并參與惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［16，18］。SNHG1基因是一種RNA基因，屬于lncRNA類。該基因在腺體腫瘤中表達(dá)普遍上調(diào)，并被認(rèn)為可通過下調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)間接促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)癌癥的發(fā)展［19］。越來越多研究指出該基因的過表達(dá)會極大地增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，并且在非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌和宮頸癌等惡性腫瘤中SNHG1基因表達(dá)水平可被視為是一種新的預(yù)后評估生物標(biāo)志物［20］。PDE6D基因主要編碼桿特異性光感受器磷酸二酯酶的δ亞基，主要參與生物學(xué)途徑包括視網(wǎng)膜桿的視覺周期和睫狀體周圍膜的物質(zhì)運(yùn)輸，與該基因有關(guān)的基因本體論注釋包括Rab GTPase結(jié)合和GTPase抑制劑活性［21］。目前尚未發(fā)現(xiàn)PDE6D基因與腫瘤的相關(guān)研究。HELLS基因是一種由RB/E2F途徑轉(zhuǎn)錄控制的基因，其主要編碼一種染色質(zhì)重塑蛋白（淋巴樣特異性解旋酶），該蛋白質(zhì)被認(rèn)為是惡性腫瘤中的表觀遺傳性狀改變和腫瘤生存所必需的物質(zhì)［22］。HELLS基因主要參與了DNA鏈的分離，并對DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)HELLS基因與轉(zhuǎn)錄因子E2F3存在相互作用，并在多種惡性腫瘤（前列腺癌、膀胱癌、肺癌等）中過度表達(dá)［23］。HELLS在多種惡性腫瘤癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，這意味著該基因可能是一個有前途的治療靶點(diǎn)［24］。GPC2基因編碼蛋白質(zhì)屬于磷脂酰肌醇聚糖家族的成員，可編碼具有硫酸乙酰肝素鏈的蛋白聚糖，并通過糖基磷脂酰肌醇錨連接到細(xì)胞表面［25］。GPC2基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞行為（包括生存、分化）的能力。因此，在多種人類癌癥中GPC2基因常存在過表達(dá)情況，異常表達(dá)的GPC2基因主要通過Wnt/β-catenin、Wnt/JNK等信號傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［26］。COPS7B基因主要編碼COP9信號體復(fù)合物的7B亞基，COP9信號體復(fù)合物可通過介導(dǎo)SCF型E3連接酶復(fù)合物的cullin亞基的腺苷酸化，是泛素共軛途徑的重要調(diào)節(jié)劑，從而降低SCF型復(fù)合物的泛素連接酶活性［27］。該復(fù)合物還可能通過與CK2和PKD激酶結(jié)合從而參與p53/TP53、JUN、ITPK1和IRF8/ICSBP等信號傳導(dǎo)途徑的磷酸化［28］。CLK2基因主要編碼一種雙重特異性蛋白激酶，該蛋白激酶可使絲氨酸/蘇氨酸和含酪氨酸的底物磷酸化，其主要參與的生物學(xué)通路包括mRNA剪接通路［29］。與該基因相關(guān)的基因本體論注釋包括轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性［30］。CEP164基因主要參與編碼微管組織、DNA損傷反應(yīng)和染色體分離的中心體蛋白［31］。最新研究指出CEP164基因是DNA損傷激活的ATR/ATM信號級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵參與者，并且能在染色體分離過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還可通過調(diào)節(jié)MDC1、RPA和CHEK1充當(dāng)維持基因組穩(wěn)定性所必須的介質(zhì)［31］。

綜上所述，本研究通過利用GEPIA和UALCAN在線分析工具和GEO數(shù)據(jù)庫檢索獲得的基因芯片，結(jié)合生物信息學(xué)的方法分析并驗(yàn)證了參與ACC發(fā)生、發(fā)展以及影響預(yù)后的差異表達(dá)基因。最終獲得TP73、SNHG1、PDE6D、GPC2、SUV 39H 2、HELLS、CLK 2、COPS7B和CEP1649個與ACC診斷及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因。上述基因既可用于評估ACC患者的預(yù)后情況又可用于ACC患者的篩選診斷，為探討ACC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及發(fā)掘ACC治療的潛在靶點(diǎn)提供了生物信息學(xué)的理論支持。