王 偉，趙四林，范伏元，金朝暉，李 妲，符 艷，孫 爽，肖雪飛，張慧卿，胡 立

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2.湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙410007）

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），簡(jiǎn)稱慢阻肺，屬于氣道慢性炎癥性疾病，近年來(lái)，其發(fā)病率不斷增加，嚴(yán)重危害人類身體健康［1，2］。COPD發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但研究表明COPD與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道平滑肌增生肥厚有關(guān)［3，4］。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）的增生肥大會(huì) 影 響COPD［5，6］。因 此 抑 制ASMCs增 殖 和 遷移是阻滯COPD進(jìn)展的重要機(jī)制之一。研究表明miRNA與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，miRNA通過(guò)各種機(jī)制在COPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可作為其診斷、治療、預(yù)后等生物標(biāo)記物［7-9］。研究報(bào)道m(xù)iR-155在COPD患者外周血中表達(dá)水平升高，miR-155可能參與了COPD的發(fā)病過(guò)程，是導(dǎo)致肺損傷的重要物質(zhì)［10］。哮喘氣道平滑肌細(xì)胞中miR-155表達(dá)升高［11］。但miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月～2019年5月于本院進(jìn)行肺部手術(shù)的8例COPD患者為觀察組，選擇3例無(wú)COPD病史的肺部良性腫瘤患者的正常肺組織作為對(duì)照組。所有患者知情并同意。

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）；胰蛋 白 酶（美 國(guó)Sigma）；Trizol、反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒（日本TaKaRa）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sciencell）；RIPA裂解液（北京百奧萊博科技有限公司）；Ki67、E-cadherin、N-cadherin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；GAPDH抗體及山羊抗兔IgG-HRP（北京索萊寶公司）；Transwell小室、Matrigel膠（美國(guó)Bio-Rad公司）；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）。

1.3 氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）分離培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)［4］，取兩組患者的肺葉和支氣管平滑肌，縱向剖開(kāi)氣管，去除氣管的內(nèi)膜和外膜，然后將平滑肌剪成1 mm3的小組織塊，將其置于培養(yǎng)瓶中，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d后可見(jiàn)從組織塊邊緣爬出少量細(xì)胞，隨后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%左右時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，成峰谷生長(zhǎng)狀。用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取穩(wěn)定傳代4～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取COPD患者ASMCs，將miR-155抑制表達(dá)質(zhì)粒anti-miR-155-A、anti-miR-155-B和陰性對(duì)照質(zhì)粒anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染至ASMCs中，記為anti-miR-155-A組、anti-miR-155-B組、anti-miR-NC組；正常培養(yǎng)的ASMCs作為空白組（blank control）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-155表達(dá)水平

收集兩組ASMCs，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，miR-155以U 6為內(nèi)參，相 對(duì) 表 達(dá) 量 采 用2-△△Ct法 計(jì) 算；具 體 參 考文獻(xiàn)［4］。

轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞采用上述方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，加入3 mL預(yù)冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A（RNase A）于37℃水浴30 min，加入碘化啶（PI），4℃避光30 min，上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù)

將適量細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)2周后用PBS清洗，經(jīng)過(guò)甲醇固定和吉姆薩染色，最后用低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行定量。然后經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗和二抗進(jìn)行孵育，再曝光顯影，定影，測(cè)定蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平；具體步驟參考文獻(xiàn)［4］。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞消化重懸后，接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h，經(jīng)固定、染色后進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，之后同細(xì)胞遷移操作；具體步驟參考文獻(xiàn)［4］。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)TNF-α、IL-6的水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155在COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

對(duì)照組及COPD組氣道平滑肌細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平分別為0.97±0.05、3.26±0.15，COPD組較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 抑制miR-155的效果檢測(cè)

空白組、anti-miR-NC組、anti-miR-155-A組及anti-miR-155-B組miR-155表達(dá)水平分別為0.94±0.08、0.95±0.09、0.32±0.03、0.20±0.02，anti-miR-155-A組和anti-miR-155-B組較空白組和anti-miR-NC組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。取變化較為明顯的anti-miR-155-B組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均用anti-miR-155表示。

2.3 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞比例而降低，細(xì)胞克隆數(shù)降低，Ki67蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1及表1。

圖1 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)的影響Fig 1 The effect of miR-155 inhibition on Ki67 protein expression in air way smooth muscle cells of COPD patients

2.4 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組遷移、侵襲氣道平滑肌細(xì)胞數(shù)降低，氣道平滑肌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2及表2。

圖2 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig 2 The effect of miR-155 inhibition on the expression of E-cadherin and N-cadherin protein in airway smooth muscle cells of COPD patients

2.5 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中炎癥因子的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中TNF-α和IL-6水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=9，±s）Tab 1 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell proliferation in COPD patients（n=9，±s）

表1 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=9，±s）Tab 1 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell proliferation in COPD patients（n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

Ki67 0.64±0.06 0.62±0.05 0.26±0.02*#189.969 0.000組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組S FP G0-G1 34.72±3.49 34.64±3.54 45.01±3.53*#25.837 0.000 34.64±3.80 34.74±3.00 24.43±2.74*#30.615 0.000 G2-M 30.64±3.29 30.62±3.35 30.56±2.99 0.002 0.998克隆數(shù)98.25±6.45 98.22±6.61 44.42±3.39*#269.298 0.000

表2 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞遷移、侵襲的影響（n=9，±s）Tab 2 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell migration and invasion in COPD patients（n=9，±s）

表2 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞遷移、侵襲的影響（n=9，±s）Tab 2 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell migration and invasion in COPD patients（n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

N-cadherin 0.77±0.04 0.75±0.03 0.36±0.02*#497.483 0.000組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組FP遷移細(xì)胞數(shù)137.28±9.15 135.12±9.36 61.64±5.63*#246.587 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)90.67±9.00 90.29±9.72 41.19±4.20*#113.229 0.000 E-cadherin 0.24±0.02 0.23±0.02 0.65±0.30*#37.547 0.000

表3 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中炎癥因子的影響（ng/L，n=9，±s）Tab 3 The effect of miR-155 inhibition on inflammatory factors in airway smooth muscle cells of COPD patients（ng/L，n=9，±s）

表3 抑制miR-155對(duì)COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中炎癥因子的影響（ng/L，n=9，±s）Tab 3 The effect of miR-155 inhibition on inflammatory factors in airway smooth muscle cells of COPD patients（ng/L，n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組IL-6 53.36±4.92 54.01±4.56 106.47±8.17*#224.424 0.000 FP TNF-α 89.43±5.12 89.22±5.59 240.25±14.35*#778.349 0.000

3 討論

COPD氣道平滑肌與氣道重塑及炎癥反應(yīng)有關(guān)，平滑肌細(xì)胞可能通過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶類、生長(zhǎng)因子等引起小氣道細(xì)胞外基質(zhì)增加，最終導(dǎo)致氣道重塑；因此調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞增殖對(duì)控制炎癥反應(yīng)和延緩氣道重塑具有重要意義［12，13］。研究表明miRNA與COPD發(fā)病及炎癥反應(yīng)相關(guān)，miRNA在COPD具有潛在的臨床治療應(yīng)用前景，可作為COPD的生物學(xué)標(biāo)志物［14，15］。已有研究表明miR-155可能參與了COPD的發(fā)病過(guò)程［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了COPD患者ASMCs中miR-155的表達(dá)水平，結(jié)果顯示COPD患者ASMCs中miR-155表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；說(shuō)明miR-155的確可能與COPD有關(guān)。有研究報(bào)道m(xù)iR-155可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換［16］。研究報(bào)道抑制miR-155促進(jìn)外膜平滑肌祖細(xì)胞的定向遷移可加劇移植性動(dòng)脈硬化［17］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-155的抑制表達(dá)質(zhì)粒研究miR-155對(duì)COPD患者ASMCs增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞比例而降低，細(xì)胞克隆數(shù)降低，Ki67蛋白表達(dá)水平降低。說(shuō)明抑制miR-155可阻滯COPD患者ASMCs周期轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞克隆的形成；且遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低，N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高。說(shuō)明抑制miR-155表達(dá)可抑制ASMCs遷移和侵襲。

COPD與氣道慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)，而氣道平滑肌細(xì)胞可影響炎性因子的釋放從而調(diào)控氣道炎癥反應(yīng)［18］。有研究報(bào)道在過(guò)敏性氣道炎癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，miR-155是2型先天淋巴樣細(xì)胞和IL-33信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［19］。miR-155參與調(diào)控吸入性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)［20］。表明miR-155可參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制miR-155表達(dá)后，COPD患者ASMCs中TNF-α和IL-6水平升高。表明抑制miR-155表達(dá)可抑制COPD患者ASMCs釋放炎性因子，抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，抑制miR-155的表達(dá)可抑制COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，抑制促炎因子的釋放。將可為COPD的治療提供新理論依據(jù)和參考。