葛瑞瑞，王 翔，湯同娟，王 靚，2，3，翟夢婷，左夢雨，陳 建，2，3，周 鵬，2，3，黃金玲，2，3

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230012）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病產(chǎn)生的病理改變，主要特征為膠原沉積的增多、排列的紊亂，Collagen I、CollagenⅢ比率的增加［1，2］，從而導(dǎo)致心室舒張功能的減退，以致誘導(dǎo)嚴(yán)重心律失常的發(fā)生，甚至出現(xiàn)心肌梗塞，引起猝死。因此，抑制心肌纖維化為治療心血管疾病的方案之一［3，4］。

研究表明，復(fù)方中藥具有多個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)途徑的作用特點(diǎn)以及副作用小的藥理作用，從而在心血管疾病的治療中得到廣泛的應(yīng)用［5］。LGZGD出自漢代張仲景《傷寒雜病論》中的經(jīng)典名方，具有溫陽健脾、化飲利水之功效，組方嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精當(dāng)，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病治療的各種病癥以及各個(gè)階段，療效顯著［6，7］。課題組前期研究證實(shí)了該復(fù)方在前心衰階段，能夠有效抑制心梗后的心室重構(gòu)，從而防治心衰的發(fā)展［8，9］。為探討該復(fù)方在抗纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用致纖維化因子TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞，觀察LGZGD對CFB膠原蛋白的分泌、以及α-SMA和FN表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性）18只，體質(zhì)量200～220 g，新生健康SD乳鼠20只（1 d齡），均購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格按照安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處置。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

苓桂術(shù)甘湯：茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草（批號(hào)：1807181、2005181、2002202、1911141）均 購 自 安 徽普仁中藥飲片有限公司。參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)［10］方法制備得到干燥粉末，再進(jìn)行分裝密封后，采取避光保存條件，備用。含藥血清的制備［11］：將SD大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組。苓桂術(shù)甘湯的灌胃劑量為8.4 g/kg，2次/d，7 d，末次給藥45 min后，腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，提取血清，水浴30 min（56℃），濾膜過濾除菌，保存（—80℃），備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清均購自（美國，賽默飛）；胰酶消化液（上海，碧云天）；TGF-β1（北京，博奧森生物）；4%多聚甲醛，Triton X-100均購自（北京，索萊寶）；波形蛋白（上海，瑞齊生物）；DAPI染色液，α-SMA抗體，Collagen I抗體，CollagenⅢ抗體，F(xiàn)N抗體，F(xiàn)N的ELISA試劑盒均購自（上海，酶聯(lián)生物）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo）；倒置熒光顯微鏡（日本，奧林巴斯株式會(huì)社）；電泳儀（美國，Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國，Protein Simple）；酶聯(lián)免疫工作站（意大利，Maroche）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取新生SD乳鼠1 d齡，無菌條件下取心室肌，剪碎，0.25%胰酶（0.5 mL/只），4℃過夜；12 h后，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（0.5 mL/只），水浴5 min（37℃）；棄液，膠原酶消化液（0.5 mL/只），水浴40 s（37℃）；將心臟置于有磁珠的含膠原酶消化液（0.6 mL/只）的血清瓶中，攪拌15 min（37℃）；留上清，1 000 r/min，5 min；留沉淀，加DMEM培養(yǎng)基（FBS+Brdu），放入培養(yǎng)箱中；靜置90 min，成纖維細(xì)胞貼壁后，換液，即獲得心肌成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至融合狀態(tài)后按1∶2傳代，用波形蛋白抗體進(jìn)行免疫染色鑒定。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分別以5×105個(gè)/mL、5×104個(gè)/mL的密度接種于6孔板及24孔板中，每孔的細(xì)胞懸液體積分別為2 mL、1 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。貼壁后，3%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)空白組、20%空白大鼠血清組、模型組和LGZGD含藥血清組（5%、10%、20%），除空白組和空白大鼠血清組，每組加入TGF-β1（5 ng/mL），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.5.3 檢測指標(biāo)及方法 免疫熒光法鑒定心肌成纖維細(xì)胞及檢測α-SMA的表達(dá)：洗板：PBS，3 min/次，3次；固定：4%多聚甲醛，15 min；洗板：同上；孵育：0.5%Triton X-100，20 min（室溫）；洗板：同上；封閉：10%正常羊血清，30 min；孵育：波形蛋白一抗（1∶200），4℃；次日，洗板：同上；孵育：熒光二抗（1∶200），1 h（室溫）；洗板：同上；染色：DAPI染色液，5 min；封片；熒光顯微鏡拍照。

WB檢測Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的表達(dá)：收集處理后的CFB，棄培養(yǎng)液，用PBS洗孔板，裂解，離心，取上清液，蛋白定量，加4×上樣緩沖液，加熱使蛋白變性。轉(zhuǎn)膜；封閉：2 h；洗膜；孵育：Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA、FN抗體，4℃；次日，洗膜；孵育：羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體，2 h；洗膜；用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Image J分析各蛋白條帶的灰度值，并以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

ELISA檢測Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達(dá)：按照ELISA試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statics 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。多組均數(shù)比較即采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFB的鑒定

CFB的形態(tài)獨(dú)特，多呈梭形；其細(xì)胞核是卵圓形，細(xì)胞之間均勻排列，且密集以致于部分重疊并交叉。免疫熒光法鑒定CFB，以成纖維細(xì)胞的特征性標(biāo)志Vimentin抗體為一抗［12］，其中環(huán)繞著細(xì)胞核的紅色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)Vimentin表達(dá)為陽性，藍(lán)色的部分為DAPI染核。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，結(jié)果顯示Vimentin陽性細(xì)胞的數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的95%以上，表明所獲的細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 CFB細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的形態(tài)（200×）Fig 1 The morphology of CFB cells after 48 h of culture（200×）

2.2 LGZGD含藥血清對α-SMA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組α-SMA的表達(dá)增高；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組的熒光強(qiáng)度依次降低，即表達(dá)減少，見圖2。

2.3 LGZGD含藥血清對Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN表達(dá)的影響

圖2 免疫熒光法檢測不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)的影響（200×）Fig 2 Immunofluor escence method to detect the effect of differ ent concentrations of LGZGD on the expr ession ofα-SMA in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1（200×）

與空白組比較，模型組Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且隨著LGZGD含藥血清濃度的增加而依次降低，見表1、圖3。

表1 各組別蛋白WB檢測結(jié)果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

表1 各組別蛋白WB檢測結(jié)果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

FN 0.467±0.003 0.415±0.009 0.993±0.004**0.603±0.016##0.563±0.009##0.437±0.016##組別空白組20%空白大鼠血清組模型組5%LGZGD含藥血清組10%LGZGD含藥血清組20%LGZGD含藥血清組Collagen I 0.270±0.015 0.225±0.022 0.974±0.011**0.555±0.053##0.242±0.017##0.140±0.017##CollagenⅢ0.562±0.013 0.473±0.011 1.048±0.014**0.865±0.015##0.778±0.014##0.656±0.001##α-SMA 0.630±0.005 0.607±0.002 1.040±0.005**0.842±0.003##0.772±0.001##0.477±0.014##

圖3 不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的影響Fig 3 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，α-SMA and FN）

2.4 LGZGD含藥血清對Collagen I、CollagenⅢ及FN表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2、圖4。

表2 各組別蛋白ELISA檢測結(jié)果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

表2 各組別蛋白ELISA檢測結(jié)果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組20%空白大鼠血清組模型組5%LGZGD含藥血清組10%LGZGD含藥血清組20%LGZGD含藥血清組FN 12.362±0.822 10.824±0.714 46.987±0.931**28.057±0.998##22.837±1.137##17.554±0.607##Collagen I 18.623±2.295 13.289±1.696 41.516±2.146**30.384±1.890##22.415±2.329##13.780±2.329##CollagenⅢ29.068±1.693 23.022±0.878 127.837±2.677**102.848±3.680##61.617±4.984##29.874±2.913##

圖4 不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞Collagen I、CollagenⅢ、及FN的影響Fig 4 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，and FN

3 討論

心肌纖維化的眾多發(fā)生機(jī)制中血管緊張素水平的提高為主要原因，且能夠促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子中，TGF-β1可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，刺激多種活性物質(zhì)的合成與分泌，參與細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成與降解，以及加快纖維化的發(fā)展等作用［13-15］。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是一種分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要成分是Collagen I和CollagenⅢ。一方面，ECM保持心臟的結(jié)構(gòu)與功能是通過維持細(xì)胞的形態(tài)并在細(xì)胞之間傳遞收縮力；另一方面，膠原蛋白的沉積、成分的改變及空間結(jié)構(gòu)的紊亂能夠?qū)е滦募±w維化。因此，抑制CFB的增殖與分化，降低其合成膠原的能力對抑制心肌纖維化具有重要意義［16-18］。α-SMA是經(jīng)典的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，除了α-SMA以外還有FN，也常用于肌成纖維細(xì)胞的鑒定，在細(xì)胞膜上高度表達(dá)，可以與膠原蛋白、纖維蛋白、TGF-β1等多種成分結(jié)合［8，19-22］；從 而 維 持 細(xì) 胞 以 及 影 響 基 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與功能［23］。

本研究采用5 ng/mL的TGF-β1刺激心肌成纖維細(xì)胞，在α-SMA的表達(dá)方面，其中WB結(jié)果表明，與空白組對比，模型組α-SMA的表達(dá)升高，與模型組比較，各濃度實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)明顯下降，有顯著性差異，其中高濃度藥物組表達(dá)的降低尤為明顯；且α-SMA免疫熒光染色結(jié)果顯示，在TGF-β1的作用下心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)的變化如尺寸增大、肌絲擴(kuò)增以及排列的密集等都十分明顯，由此說明TGF-β1有效地誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，給予LGZGD含藥血清干預(yù)后，熒光強(qiáng)度隨著濃度的升高而減弱。在FN的表達(dá)方面，與空白組對比，模型組FN的表達(dá)增加，與模型組比較，各濃度實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)明顯下降，有顯著性差異，其中高濃度藥物實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)的下降尤為明顯。在膠原蛋白合成方面，與空白組對比，模型組Collagen I及CollagenⅢ蛋白合成增加，與模型組比較，Collagen I蛋白及CollagenⅢ的表達(dá)下降，有顯著性差異，這說明LGZGD能夠抑制膠原合成，提示LGZGD具有在一定程度上拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化作用，抑制心肌纖維化，從而發(fā)揮其保護(hù)心肌的作用。但是LGZGD并不能完全抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFB的膠原合成，這可能與心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展有多種因素有關(guān)［24，25］。綜上所述，LGZGD對TGF-β1誘導(dǎo)的CFB的膠原合成、肌纖維化標(biāo)志物α-SMA以及FN具有明顯的抑制作用，以及抗纖維化作用。但是該方的具體機(jī)制仍然有待后續(xù)進(jìn)一步研究，課題組接下來會(huì)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測LGZGD治療心肌纖維化的有效成分和作用靶點(diǎn)，并采用體內(nèi)外相結(jié)合的方法對預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行下一步的驗(yàn)證。