周正煒，郭派派，王曼曼，孫寒飛，王 珍，邰 宇，劉 琪，張巧琳，吳華勛，汪慶童，魏 偉

多種疾病可引起唾液腺功能減退，典型代表為干燥綜合征(Sjogren′s syndrome, SS)，目前尚無有效的治療藥物。已有研究表明，唾液腺中的成纖維細(xì)胞異常活化，產(chǎn)生大量膠原，引起唾液腺發(fā)生纖維化是SS患者唾液腺功能損傷，唾液分泌量減少的重要病理機(jī)制。因此對唾液腺成纖維細(xì)胞功能異常的發(fā)生機(jī)制、細(xì)胞功能改善方法的研究有助于深入理解SS病理機(jī)制和尋找有效的治療手段。實(shí)驗(yàn)動物原代唾液腺成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)將為上述研究提供實(shí)驗(yàn)保障。然而目前尚沒有成熟的原代唾液腺成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究的開展頗為困難。該課題組通過胰酶消化法成功的從新生大鼠頜下腺中分離得到形態(tài)良好、純度較高的成纖維細(xì)胞，并摸索出適合的培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平開展SS研究提供實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級新生48 h內(nèi)的SD乳鼠4只，體質(zhì)量5～6 g，雌雄不限，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK(皖)2017-001。本實(shí)驗(yàn)方案已通過安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM/F12 1 ∶1培養(yǎng)基、DPBS購自美國HyClone公司；青霉素-鏈霉素溶液(×100)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、DAPI染色液、抗熒光猝滅封片液購自上海Beyotime公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自以色列Biological Industries公司；明膠購自北京Solarbio公司；兔抗波形蛋白多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體、CoreLite488標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Proteintech公司；羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗購自美國Jackson Immuno Research公司；人下頜下腺細(xì)胞(human salivary gland, HSG)購自寧波明舟生物科技有限公司；Anti-Mo/Rt CD90 PE購自美國eBioscience公司。倒置顯微鏡購自美國GE Healthcare Life Sciences公司；Image Xpress Micro 4 型高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)購自美國Molecular Devcies公司；BD FACSAriaTMII Cell Sorter 分選流式購自美國BD公司。

1.3 頜下腺成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

1.3.1

培養(yǎng)皿明膠包被

1 g明膠加100 ml雙蒸水，高壓蒸汽滅菌，在培養(yǎng)皿中加入2 ml稀釋為0.1%的明膠溶液，輕輕搖晃，使明膠溶液均勻分布在培養(yǎng)皿底部，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中1 h，取出后棄上清液備用。

1.3.2

取材 將SD乳鼠置于75%酒精缸中浸泡5 min，無菌條件下使用眼科剪取出頸部兩側(cè)頜下腺，除去結(jié)締組織及包膜，用預(yù)冷的DPBS反復(fù)洗滌3～5遍，將組織轉(zhuǎn)移至無菌1.5 ml EP管中，充分剪碎(<1 mm)，再移至15 ml的離心管中。

1.3.3

胰酶消化 在裝有組織的15 ml離心管中加入5 ml 0.125%胰酶消化液(0.25%胰酶、DPBS=1 ∶1)吹打30～60 s，置于37 ℃恒溫箱中振蕩5 min，再反復(fù)吹打30～60 s，靜置3 min，用無菌吸管吸取上清液，將上清液用100目篩網(wǎng)過濾后加入15 ml離心管，并加入同體積DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素溶液)終止消化。未消化的組織再次加入5 ml 0.125%胰酶消化液，吹打30～60 s后再次置于37 ℃恒溫箱中振蕩5 min，靜置吸取上清液，總計消化3次，組織基本消失。

1.3.4

細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 將分次收集的細(xì)胞懸液以1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入5 ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素溶液)重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，此后每2～3 d換液1次；待細(xì)胞融合達(dá)80%左右，用0.25%胰酶消化傳代至無明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4 頜下腺成纖維細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定

1.4.1

形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況。

1.4.2

免疫熒光法檢測細(xì)胞波形蛋白表達(dá) 取第2代細(xì)胞、MH7A、HSG細(xì)胞株進(jìn)行爬片，貼壁24 h后，室溫固定、破膜封閉，加入1 ∶200的兔抗波形蛋白多克隆抗體4 ℃孵育過夜；充分洗滌后加入1 ∶200 CoreLite488標(biāo)記的羊抗兔二抗避光孵育1 h，DAPI染核8 min，防淬滅熒光劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3

Western blot檢測細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)水平 用細(xì)胞裂解液提取本方法獲得的原代頜下腺細(xì)胞以及MH7A、HSG細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后用1 ∶4 000的兔抗波形蛋白多克隆抗體或1 ∶20 000鼠抗GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，1 ∶40 000相應(yīng)二抗37 ℃孵育2 h后加入ECL顯影液曝光，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.4.4

RT-PCR檢測波形蛋白mRNA的表達(dá) 使用TRIzol溶液，抽提MH7A細(xì)胞、原代頜下腺成纖維細(xì)胞和HSG細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用TB Green Premix Ex TaqⅡ試劑盒對波形蛋白mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參。引物： vimentin(Rat) 上游：5-AGCGCTCCTACGATTCACAG-3，下游：5-TGTGGACGTGGTCACATAGC-3; vimentin(human)上游：5-TCCGCACATTCGAGCAAAGA-3, 下游：5-TGATTCAAGTCTCAGCGGGC-3；GAPDH(Rat) 上游：5-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3，下游：5-TCTGTGGTGATGTAAATGTCCTCT-3；GAPDH(human) 上游：5-AATGGGCAGC-CGTTAGGAAA-3，下游：5-GCGCCCAATACGAC-CAAATC-3；按照2法計算mRNA表達(dá)量。

1.4.5

流式細(xì)胞術(shù)檢測成纖維細(xì)胞純度 收集第3代細(xì)胞，PBS洗滌后重懸，孵育CD90表面抗體，分選流式分選出陽性細(xì)胞，將分選出的陽性細(xì)胞按1 ∶1體積加入破膜劑，兔抗波形蛋白多克隆抗體孵育40 min，CoreLite488標(biāo)記的羊抗兔二抗避光孵育30 min，同型對照組只孵育二抗，PBS洗滌細(xì)胞，200 μl PBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測。

1.5 高內(nèi)涵檢測不同濃度血清以及不同時間對細(xì)胞增殖能力的影響

將密度為2×10/ml的第3代頜下腺成纖維細(xì)胞，分別重懸于含0%、5%、10%、15%、20% FBS的培養(yǎng)液中，接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)12、24、48 h，棄培養(yǎng)液，室溫固定，DAPI染核8 min，充分洗滌后每孔加入100 μl PBS，高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)拍攝并計算每孔細(xì)胞總量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GrapdhPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間差異的比較采用單因素方差分析，以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

剛消化分離獲得的細(xì)胞呈亮球形，輪廓清晰，單個散在分布或聚集成細(xì)胞團(tuán)(圖1A)；皿中培養(yǎng)90 min后即有大量細(xì)胞貼壁，其中部分已開始伸展(圖1B)；24 h后大多數(shù)貼壁細(xì)胞已伸展成短梭形，并且散在生長(圖1C)；3～4 d時細(xì)胞呈細(xì)長梭形或多角形，胞核清晰，一般不形成集落(圖1D)；5～6 d時可發(fā)生融合，漩渦狀或縱橫狀排列，貼壁的細(xì)胞團(tuán)呈放射狀生長，待細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時進(jìn)行傳代培養(yǎng)(圖1E)；傳代后細(xì)胞貼壁及伸展速度更快，多數(shù)細(xì)胞在消化處理后60 min開始伸展。1～2 d即可發(fā)生融合生長(圖1F)。隨傳代次數(shù)的增加，至第五代以后，細(xì)胞生長開始變慢，并出現(xiàn)一些體積較大，扁平伸展的紡錘形細(xì)胞或星形細(xì)胞，逐漸失去梭形形態(tài)(圖1G)。提示消化培養(yǎng)2～5代的頜下腺成纖維細(xì)胞適用于開展體外實(shí)驗(yàn)。

圖1 組織分離培養(yǎng)的頜下腺成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 ×50

圖2 新生大鼠頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)情況

2.2 原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞鑒定

2.2.1

SD大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)和分布情況 免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的第2代新生SD大鼠頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。HSG細(xì)胞株為人下頜下腺上皮樣細(xì)胞，有較弱的波形蛋白染色，與頜下腺成纖維細(xì)胞相比差異較大(

P

<0.001)，MH7A細(xì)胞株為滑膜成纖維細(xì)胞，有較強(qiáng)的波形蛋白染色，與頜下腺成纖維細(xì)胞相比差異較小(

P

<0.05,

F

=628.7)(圖2)，提示從新生SD大鼠頜下腺分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞符合成纖維樣細(xì)胞的特征。

2.2.2

SD大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)水平 提取原代大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞、MH7A細(xì)胞和HSG細(xì)胞蛋白，Western blot法檢測細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)得到的頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白(相對分子量為54 ku)表達(dá)水平較高；作為對照，MH7A細(xì)胞波形蛋白表達(dá)較強(qiáng)，人HSG細(xì)胞波形蛋白表達(dá)微弱，與MH7A細(xì)胞相比，波形蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與HSG細(xì)胞相比，波形蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01，

F

=22.06)(圖3)。

2.2.3

SD大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平 抽提MH7A細(xì)胞、原代頜下腺成纖維細(xì)胞和HSG細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測波形蛋白mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)得到的頜下腺成纖維細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平較高；作為對照，MH7A細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平較強(qiáng)，人HSG細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平較弱。原代頜下腺成纖維細(xì)胞與MH7A細(xì)胞的波形蛋白mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，HSG細(xì)胞與頜下腺成纖維細(xì)胞相比，波形蛋白的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.001，

F

=64.65)(圖4)。

圖3 MH7A細(xì)胞、原代大鼠乳鼠頜下腺 成纖維細(xì)胞和HSG細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)水平

圖4 MH7A細(xì)胞、原代大鼠乳鼠頜下腺 成纖維細(xì)胞和HSG細(xì)胞中相對波形蛋白mRNA的表達(dá)水平

2.2.4

原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞純度檢測 大鼠乳鼠頜下腺組織經(jīng)消化獲得的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)第3代的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)分選流式分選后，固定破膜，經(jīng)間標(biāo)法標(biāo)記細(xì)胞中的波形蛋白，并設(shè)立僅二抗染色的同型對照。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)傳代培養(yǎng)3次，組織細(xì)胞培養(yǎng)體系中波形蛋白陽性的細(xì)胞約為87%，提示經(jīng)酶消化法獲得的大鼠乳鼠頜下腺組織細(xì)胞中，經(jīng)分選流式分選后成纖維細(xì)胞含量較高，可滿足以其為對象的體外研究需要。(圖5)。

2.2.5

不同培養(yǎng)條件對原代培養(yǎng)的大鼠頜下腺成纖維細(xì)胞生長的影響 為探索原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞較合適的培養(yǎng)條件，96孔板每孔加入相同數(shù)量的原代大鼠頜下腺成纖維細(xì)胞，給予含0%、5%、10%、15%、20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12、24、48 h，培養(yǎng)結(jié)束固定細(xì)胞，DAPI染色，高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)計算細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，大鼠頜下腺成纖維細(xì)胞在含5%、10%FBS的培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好；與0% FBS培養(yǎng)基組比較，其他各組不同血清含量培養(yǎng)的細(xì)胞，在24 h均增殖明顯(

P

<0.001)，48 h的培養(yǎng)不能進(jìn)一步提高細(xì)胞數(shù)量；在培養(yǎng)24和48 h時，與含5% FBS培養(yǎng)基組比較，10%、15%、20%FBS細(xì)胞數(shù)量相對減少(

P

<0.01，

F

=14.34)(圖6)，提示含5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基適用于細(xì)胞的維持培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后即大量增殖。

3 討論

唾液腺是一種復(fù)雜的分泌組織，可產(chǎn)生唾液并維持口腔穩(wěn)態(tài)。多種因素引發(fā)唾液腺疾病,比如自身免疫性疾病、輻射誘發(fā)的唾液腺萎縮等。目前對于唾液腺疾病的病理機(jī)制尚不十分明確，最主要的研究集中在唾液腺的T、B淋巴細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等。大量文獻(xiàn)表明，T、B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等在唾液腺疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。目前也有研究顯示，唾液腺成纖維細(xì)胞的異常活化在唾液腺疾病的發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，成纖維細(xì)胞異?；罨置诖罅康睦w維蛋白，導(dǎo)致腺體功能減退，唾液分泌減少，但對于唾液腺中成纖維細(xì)胞異?；罨臋C(jī)制研究相對較少，課題組前期查詢到有小鼠頜下腺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞株，但目前并沒有較好的方法分離提取原代頜下腺成纖維細(xì)胞，使得在體外開展相關(guān)唾液腺成纖維細(xì)胞的機(jī)制研究難度較大，尤其是在使用敲基因小鼠研究唾液腺疾病的發(fā)生機(jī)制時體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)展頗為困難。故建立一種穩(wěn)定、有效的體外原代頜下腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法對唾液腺疾病的研究、防治有著深遠(yuǎn)意義。

圖5 原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞純度檢測

圖6 不同濃度FBS對原代培養(yǎng)的大鼠 乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞生長的影響

課題組前期查詢到乳鼠的其他部位如乳腺等腺體的原代成纖維細(xì)胞提取的相關(guān)文獻(xiàn)或者心臟、肺等組織的原代成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究, 并未查到關(guān)于原代頜下腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)前期利用組織塊貼壁法，發(fā)現(xiàn)腺體黏液較多，組織塊并不能很好的貼壁吸附，提取出來的細(xì)胞較少；在探索實(shí)驗(yàn)方法中發(fā)現(xiàn)胰酶消化后培養(yǎng)，能使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，并且能夠清楚地觀察到細(xì)胞的狀態(tài)，但是胰蛋白酶對細(xì)胞膜有較大損傷，濃度過高或者消化時間過長，都有可能損傷細(xì)胞，使得細(xì)胞喪失貼壁能力。最終采用0.125%胰蛋白酶多次消化頜下腺，收集消化后的單細(xì)胞懸液。由于頜下腺腺體是混合型腺體，提取出來的細(xì)胞混雜有上皮細(xì)胞等其他貼壁細(xì)胞。成纖維細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，生長較快，本課題組對提取的細(xì)胞在第3代進(jìn)行了純度鑒定。CD90是成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，經(jīng)流式檢測CD90陽性細(xì)胞占比約87%，經(jīng)分選流式分選出CD90陽性細(xì)胞，再經(jīng)間標(biāo)法標(biāo)記波形蛋白，純度約達(dá)99%，基本達(dá)到體外實(shí)驗(yàn)需求。

本實(shí)驗(yàn)采用胰酶消化法分離提取的原代頜下腺成纖維細(xì)胞，通過鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：呈細(xì)長梭形或多角形、漩渦狀或縱橫狀排列，符合成纖維細(xì)胞的表征，與MH7A細(xì)胞形態(tài)相似，區(qū)別于HSG細(xì)胞株形態(tài)。Western blot法驗(yàn)證波形蛋白表達(dá), 為單一清晰條帶。波形蛋白染色呈陽性鑒定細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，并且與HSG細(xì)胞相比有較大差別。分離培養(yǎng)的第3代細(xì)胞經(jīng)分選流式分選后，流式鑒定純度達(dá)87%，可滿足以其為對象的體外研究需要。高內(nèi)涵檢測頜下腺成纖維細(xì)胞生長能力表明，含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基可用于細(xì)胞的維持培養(yǎng)。第5代及第5代之后細(xì)胞出現(xiàn)生長速度慢, 死細(xì)胞數(shù)量稍有增多, 出現(xiàn)一些體積較大、扁平伸展的紡錘形細(xì)胞或星形細(xì)胞。分析原因可能是傳代次數(shù)多、細(xì)胞活力下降、細(xì)胞老化、分裂增殖緩慢等情況，提示提取分離的原代大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞2～4代可用于開展體外實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述, 本研究基本確立了大鼠乳鼠頜下腺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，細(xì)胞具有較穩(wěn)定的生物學(xué)特性和較高的純度，并篩選出較合適的培養(yǎng)條件。為唾液腺成纖維細(xì)胞的體外功能研究提供了細(xì)胞獲得方法及良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。