胡亞琴，汪佳佳，吳 昊，劉 青，唐麗琴,2，魏 偉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)被認為是造成終末期腎臟功能衰竭的主要原因之一。DN的主要病理變化是腎小球系膜細胞(mesangial cells, MCs)異常增殖,腎小球系膜基質(zhì)擴張和基底膜增厚，MCs的異常增殖是導致腎小球系膜基質(zhì)增加和細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)沉積增加的重要原因，而Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ, Col-Ⅳ)和纖維連接蛋白(fibronectin, FN)是ECM的主要成分。研究表明，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化過程中具有重要作用。促分裂原激活激酶1(mitogenstress activated kinase 1, MSK1)是ERK的下游激酶，可誘導核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)的激活。小檗堿(berberine, BBR)具有抗氧化活性、調(diào)節(jié)血脂和減輕炎癥等多種藥理作用。課題組前期研究表明，BBR可能在抑制腎小球MCs的增殖和分泌中起重要作用。該研究通過探討B(tài)BR能否調(diào)節(jié)ERK/NF-κB信號通路改善高糖誘導的MCs的異常增殖，進一步研究BBR對DN的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞

小鼠MCs株(147589)購自中科院上海細胞庫。

1.1.2

藥物

BBR(BW 50137)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究所，純度為98.37%(液相色譜法)。配置方法：稱量BBR粉末20.182 5 g，加入5 ml生理鹽水，并通過加熱和超聲處理使其完全溶解，得到終濃度為1.2×10μmol/L的BBR母液，采用0.22 μm無菌濾器除去細菌后-20 ℃存放。使用前水浴加熱，使其溶解后，稀釋數(shù)倍至所需濃度即可。

1.1.3

試劑

CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰酶、一抗稀釋液、二抗稀釋液，DAPI 染液及防熒光淬滅劑購自上海碧云天生物技術研究所；6孔細胞培養(yǎng)板購自無錫NEST公司；鼠源FN購自武漢Proteintech公司；兔源Col-Ⅳ購自英國Abcam公司；兔源ERK、p-ERK購自美國affinity公司；IκB、p-IκB、p65、p-p65購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.4 儀器

電泳儀購自北京六一儀器廠；SW-CJ-1F 超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團安泰公司；BioTek Elx×808 酶標儀購自美國BioTek 公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國萊卡公司；Image Xpress Micro 4 型高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)購自美國Molecular Devcies 公司；ImageQuant LAS 4000熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE Healthcare Life Sciences公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存細胞，在37 ℃水浴中解凍并離心，使用含有10% FBS和1%雙抗的DMEM低糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，在5% CO和37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞。

1.3 細胞活力

CCK-8法檢測處于指數(shù)生長期的MCs，將100 μl/孔的MCs單細胞懸液(約10個細胞)鋪于96孔培養(yǎng)板中，每組另設立5個平行對照組；待細胞完全貼壁后，分為對照(Control, 11.1 mmol/L葡萄糖)組，高糖(high gloss, HG)模型(HG，30 mmol/L葡萄糖)組和BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)。給藥24 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液后，避光孵育，每隔30 min使用酶標儀測定每組在450 nm處的吸光度。取各組實驗的平均值，重復3次實驗。

1.4 高內(nèi)涵細胞成像法檢測細胞增殖

將100 μl/孔的MCs單細胞懸液(約10個細胞)鋪于96孔培養(yǎng)板中，每組另設立5個平行對照組；待細胞貼壁完全后，分為Control組、 HG組和BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)。給藥24 h后，使用PBS將細胞清洗2遍后，多聚甲醛固定30 min, 每孔加入20 μl的DAPI溶液染色5 min，棄DAPI染色液，加入PBS后，使用高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)可以完整拍攝整孔細胞，每孔拍攝25張圖片。細胞數(shù)統(tǒng)計：測量圖片中細胞核直徑的最大與最小值，設定細胞核直徑的識別范圍；測量細胞核熒光強度的最大與最小值，減去背景熒光強度，設定熒光強度的識別范圍，通過此兩個標準統(tǒng)計細胞總數(shù)，選擇模塊以分析細胞總數(shù)并將結(jié)果導出至 Excel表格。

1.5 激光共聚焦法檢測FN和Col-Ⅳ的表達

用胰酶消化細胞后，對細胞進行計數(shù)，將500 μl/孔的MCs單細胞懸液(約10個細胞)鋪于含有蓋玻片的24孔板內(nèi)，待細胞貼壁，分為Control組、HG組和BBR給藥組，細胞培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS清洗3遍，每次5 min，棄去PBS；4%多聚甲醛室溫下固定細胞30 min后， PBS清洗細胞3遍，每次5 min，棄去PBS；5% BSA室溫下封閉30 min后， PBS清洗細胞3遍，每次5 min，棄去PBS；一抗(1 ∶100) 4 ℃過夜；回收一抗后， PBS清洗細胞3遍，每次5 min，棄去PBS；加入熒光二抗200 μl，室溫下避光孵育1 h后， PBS清洗3遍，每次10 min，棄去PBS；加入DAPI染液200 μl染核10 min后， PBS清洗細胞3遍，每次10 min，棄去PBS；將蓋玻片放置平面上，待其干后，將防熒光淬滅劑滴在載玻片上進行封片，蓋玻片四周涂上指甲油用來密封。使用激光共聚焦顯微鏡對細胞觀察拍照。

1.6 Western blot檢測相關蛋白表達

取對數(shù)生長期細胞，將 2 ml/孔的MCs單細胞懸液(約10個細胞)接種于6孔板中，處理同“1.3”項，培養(yǎng)24 h后，使用PBS清洗2遍，棄去PBS，現(xiàn)配RIPA加PMSF后，使之充分裂解后，收集上清液，使用BCA測定蛋白濃度。將蛋白上樣緩沖液加入到蛋白樣品中，100 ℃水浴10 min，然后完成上樣，跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟，用目的蛋白抗體4 ℃孵育過夜，使用TPBS洗膜3次后，用適宜濃度的二抗工作液37 ℃孵育2 h，顯影后使用灰度圖分析得出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 BBR對MCs增殖活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示(圖1)，與Control組相比，HG能增加MCs增殖活力(

P

<0.01)；與HG組相比，BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)均能降低MCs增殖活力。

圖1 BBR對HG誘導的系膜細胞活力的影響

2.2 BBR對MCs增殖能力的影響

高內(nèi)涵結(jié)果顯示(圖2)，與Control組相比，HG能增加MCs數(shù)量(

P

<0.01)；與HG組比較，BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)均能抑制MCs的異常增殖。

圖2 BBR對HG誘導的系膜細胞增殖的影響 與Control組比較：##P<0.01；與HG組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖3 BBR對FN和Col-Ⅳ的表達水平影響的 ×400

2.3 BBR對FN和Col-Ⅳ表達的影響

激光共聚焦結(jié)果顯示(圖3)，與Control組相比，HG組的FN和Col-Ⅳ的表達升高；與HG組比較，BBR給藥組(90 μmol/L)的FN和Col-Ⅳ的表達降低。

2.4 BBR對MCs上ERK/NF-κB蛋白表達水

平的影響

ERK/NF-κB信號通路是參與細胞異常增殖的重要調(diào)節(jié)因子。Western blot結(jié)果顯示(圖4)，與Control組相比，HG組中MCs上p-ERK、p-MSK1、p-IκB和p-p65蛋白表達水平升高(

P

<0.01)，BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)能夠有效降低MCs上p-ERK、p-MSK1、p-IκB和p-p65蛋白表達水平。

圖4 BBR對ERK/NF-κB信號通路相關蛋白的的影響

3 討論

DN被認為是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，也是造成終末期腎臟功能衰竭的主要原因。研究表明，DN主要是由于非酶促造成糖化、氧化應激、腎血流動力學變化、血脂異常、高血壓、蛋白激酶激活、血管活性物質(zhì)等因素造成的。腎小球系膜區(qū)由MCs和其自身分泌的細胞外基質(zhì)共同組成，對維持腎小球毛細血管網(wǎng)發(fā)揮了重要的支撐作用。此外，MCs具有一定的收縮功能，可通過調(diào)節(jié)細胞的收縮與舒張來參與腎小球的血流供應，具有維持系膜基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和濾過作用。因此，MCs在維持腎小球正常功能中發(fā)揮了重要作用。在DN的病理發(fā)展過程中，MCs的異常增殖在早期腎肥大和晚期腎小球硬化中起了關鍵作用。研究顯示，多種刺激對MCs的增殖反應都與DN的發(fā)生及發(fā)展有關，其中高糖是MCs異常增殖的最有效刺激。高糖刺激MCs后，將會導致MCs的異常增殖和ECM，從而導致腎小球基底膜增厚以及腎小球系膜區(qū)基質(zhì)沉積，最終導致腎小球硬化。在本次實驗中，用30 mmol/L葡萄糖成功刺激MCs 24 h后，檢測顯示與Control組比較，HG組MCs個數(shù)增多，細胞增殖活力增強，MCs發(fā)生異常增殖，MCs上的FN和Col-Ⅳ的表達水平升高。

研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)作為真核細胞胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導終末通路，與DN的發(fā)病機制密切相關，而ERK是最具代表性的MAPK之一。在DN模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷ERK通路后導致MCs增殖減少，這表明了ERK在保護MCs中的重要作用。此外，在人類腎小球病變中，ERK通路的激活參與了細胞增殖、組織學病變和腎功能不全。在高糖刺激后，將導致ERK的一連串的磷酸化，使ERK1和ERK2的2種同工型的Thr-Glu-Try基序雙重磷酸化。ERK的磷酸化形式是一種活性激酶，可以使包括NF-κB在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)錄因子磷酸化。在細胞中，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子由于抑制蛋白(包括IκBα、IκBβ、IκBε和IκB)保留在胞質(zhì)中。刺激后，IKKs在32和36個絲氨酸殘基處都將IκBα抑制蛋白磷酸化，從而發(fā)生泛素化和蛋白酶體降解，隨后導致NF-κB從細胞質(zhì)到核的核易位，入核的NF-κB與基因啟動子的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，并參與炎癥基因的表達。

BBR目前已廣泛應用于治療胃腸炎和分泌性腹瀉等疾病。研究表明，BBR具有如抗氧化應激、抗炎、抗微生物和抗癌等廣泛的藥理活性，在DN進展中發(fā)揮了重要的腎臟保護作用。本研究通過在體外使用HG刺激MCs，同時使用不同濃度的BBR治療，來觀察BBR抑制MCs異常增殖的藥理機制，通過檢測MCs的細胞增殖活力、增殖能力、MCs上相關蛋白的表達水平，可知BBR在高糖環(huán)境下可以抑制MCs的異常增殖，減少ECM，并且可以有效調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下MCs上ERK/NF-κB信號通路的表達，從而抑制MCs的異常增殖。

綜上所述，本研究提示HG能促進MCs的異常增殖與ECM沉積，而BBR能明顯逆轉(zhuǎn)此過程，其機制可能與調(diào)節(jié)MCs上ERK/NF-κB信號通路的活化有關。