王 新，盧朝輝，李雅睿，郭 丹，張 旭，曹 琰，李皓瑞，和水祥，盧新蘭

由于非酒精性脂肪肝及其相關性肝癌患病人數(shù)逐年增加，其致癌機制是目前的研究熱點。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一種脂代謝中的磷脂分子，具有類生長因子的生物活性，可能是肝臟炎癥、脂代謝紊亂與肝癌發(fā)生之間重要的橋梁分子。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素合成限速酶，在肝癌等多種癌組織中過表達。在卵巢癌中，LPA可通過轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白β(C/EBPβ)誘導COX-2高表達。多種抗炎藥同時具有抗腫瘤活性。青藤堿是從中藥青風藤中提取出的生物堿單體，鹽酸青藤堿(sinomenine hydrochloride，SIN)是水溶性鹽酸鹽，具有抗炎、抗免疫藥理作用，臨床上用于治療關節(jié)炎，課題組前期研究已證實其抗肝癌活性。目前在肝癌中LPA與COX-2關系如何及SIN是否調控LPA相關信號通路尚不清楚。該研究探討LPA能否誘導人肝癌Huh7細胞COX-2表達、增殖及其可能機制，并驗證SIN對其可能的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑

人肝癌Huh7細胞由西安交通大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所凍存保種。SIN(純度>98%)購自上海abcam公司；MTT、DMSO、LPA(純度>98%)購自上海Sigma-Aldrich公司，其中LPA用PBS溶解成母液，由無血清細胞培養(yǎng)液稀釋成工作液；DMEM培養(yǎng)液購自美國Gbico公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；小鼠抗人C/EBPβ、COX-2、GAPDH單抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物公司；Fast 200總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng)

人肝癌Huh7細胞常規(guī)培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于5% CO、濕度95%、37 ℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱內。待細胞生長到鋪滿細胞培養(yǎng)皿底面80%左右進行傳代。細胞在用LPA處理前用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.2

Real

-

time

PCR測定mRNA表達水平

采用Fast 200總RNA極速抽提試劑盒提取不同處理組Huh7細胞總RNA，定量后按0.4 μg上樣量逆轉錄合成cDNA。定量逆轉錄反應產物調整后濃度為0.2 g/L，上樣量為200 ng，按照說明書進行Real-time PCR反應。GAPDH為內參對CHOP mRNA的表達量進行標準化處理。反應體系(20 μl)：10 μl SYBR，0.2 μg模板cDNA，正反向引物濃度均為20 μmol/L，體積為0.8 μl，使用滅菌蒸餾水使總體積達20 μl。PCR過程：40個循環(huán)、94 ℃、1 min；54 ℃、1 min；聚合72 ℃、1 min；延伸72 ℃、7 min。mRNA的相對表達倍數(shù)使用公式2計算。根據(jù)NCBI官網提供的人基因信息，按照引物設計原則設計人C/EBPβ、COX-2和GAPDH基因引物序列。C/EBPβ正向引物：5′-TTCCTCTCCGACCTCTTCTC-3′，反向引物：5′-CCAGACTCACGTAGCCGTACT-3′；COX-2正向引物：5′-AAGTCCCTGAGCATCTACG-3′，反向引物：5′-TTCCTACCACCAGCAACC-3′；GAPDH正向引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′，反向引物：5′-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3′。

1.2.3

Western

blot測定蛋白表達水平

Huh7細胞給予不同處理后，加入RIPA全蛋白裂解液(含Cocktail和PMSF)提取細胞總蛋白。用Bradford法測定裂解產物的蛋白濃度。30 μg的蛋白樣品上樣至120 g/L的SDS-PAGE凝膠進行電泳分離蛋白，隨后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，然后加入適量一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入適量二抗稀釋液在室溫條件下孵育1 h。采用ECL檢測系統(tǒng)進行顯色、曝光、沖洗X膠片，使用掃描儀進行掃描。

1.2.4

MTT法檢測細胞增殖

人肝癌Huh7細胞經消化、離心后，以6 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細胞分為：對照組(無血清培養(yǎng)液)、LPA組(10 μmol/L)、SIN+LPA組。SIN+LPA組中細胞先加入SIN(100、400 μmol/L)預處理1 h，隨后加入10 μmol/L LPA。上述各組細胞處理后培養(yǎng)24 h后，原培養(yǎng)液被吸除后加入MTT工作液(0.5 g/L)200 μl，繼續(xù)孵育4 h后將MTT工作液吸除，在每孔中加入DMSO(150 μl)后于振蕩器上振蕩10 min，將酶標儀吸收波長設定為490 nm，測出每孔的相對吸光度(optical density, OD)值。相對細胞活力(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。

2 結果

2.1 LPA時間依賴性誘導人肝癌Huh7細胞C/EBPβ和COX-2表達

無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用10 μmol/L LPA處理人肝癌Huh7細胞0、0.5、1、2、4、6 h。收集細胞總蛋白后，通過Western blot顯示LPA能夠時間依賴性上調Huh7細胞的C/EBPβ和COX-2蛋白表達水平，其中LPA處理6 h后變化最為顯著(圖1A)。用10 μmol/L的LPA處理細胞2、6 h，提取細胞總RNA后通過Real-time PCR檢測顯示，LPA能夠時間依賴性上調C/EBPβ和COX-2的mRNA表達水平(圖1B)。

圖1 LPA時間依賴性上調人肝癌Huh7細胞的C/EBPβ和COX-2表達

2.2 LPA濃度依賴性誘導人肝癌Huh7細胞C/EBPβ和COX-2表達

LPA處理組為各濃度LPA(0、0.5、1、5、10 μmol/L)分別處理細胞6 h，收集細胞總蛋白后，通過Western blot顯示LPA能夠濃度依賴性上調人肝癌Huh7細胞C/EBPβ和COX-2蛋白表達水平，其中10 μmol/L LPA濃度組變化最為顯著(圖2A)。用1、10 μmol/L的LPA分別處理細胞6 h，提取細胞總RNA并通過Real-time PCR技術檢測顯示，LPA能夠濃度依賴性上調C/EBPβ和COX-2的mRNA表達水平(圖2B)。

2.3 SIN通過下調C/EBPβ、COX-2表達抑制LPA所誘導的人肝癌Huh7細胞增殖

SIN+LPA組細胞中加入不同濃度(100、200、400、800 μmol/L)SIN預處理1 h后加入10 μmol/L LPA，LPA組中僅加入10 μmol/L LPA，對照組中加入無血清培養(yǎng)液，6 h后收集各組細胞總蛋白。通過Western blot顯示SIN能夠濃度依賴性下調LPA所誘導的Huh7細胞中C/EBPβ和COX-2蛋白表達水平(圖3A)。用200、400 μmol/L的SIN分別預處理細胞1 h后加入10 μmol/L的LPA，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后提取細胞總RNA并行Real-time PCR檢測C/EBPβ和COX-2 mRNA表達水平，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后行MTT檢測細胞增殖。如圖3B、C中所示，SIN濃度依賴性抑制LPA所誘導的人肝癌Huh7細胞C/EBPβ、COX-2 mRNA表達和增殖。

圖2 LPA濃度依賴性上調人肝癌Huh7細胞的C/EBPβ和COX-2表達

3 討論

自分泌運動因子(autotaxin, ATX)是能將底物溶血磷脂酰膽堿催化成為LPA的酶。ATX/LPA信號軸分泌及表達增加是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要步驟之一。研究表明，肝纖維化患者血中ATX和LPA水平升高，與丙肝、肝硬化的分期和并發(fā)癥相關；肝癌患者血清LPA水平升高與腫瘤負荷相關。一些促炎細胞因子如TNF-α能夠激活ATX/LPA信號通路，進而促進炎癥相關的肝癌發(fā)生。此外，LPA激活p38絲裂原活化蛋白激酶和Rho/p160ROCK信號通路信號通路，促進肝癌細胞粘附、遷移和侵襲。一項關于肝癌中基質/腫瘤相互作用的研究表明，LPA由肝癌細胞旁分泌并促進成對瘤周組織成纖維細胞向癌相關成纖維細胞樣表型的轉化，從而誘導肝癌細胞增殖、遷移和侵襲?？傊?，LPA直接參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖3 SIN濃度依賴性抑制LPA所上調的人肝癌Huh7細胞C/EBPβ、COX-2表達和增殖

COX-2可被包括LPA在內的多種生長因子、炎癥因子誘導表達，其在肝癌組織中高表達，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關。本研究證實LPA能夠時間及濃度依賴性誘導人肝癌Huh7細胞COX-2的轉錄及翻譯水平升高。COX-2基因的表達可被諸多轉錄因子如C/EBPβ調控，因其啟動子區(qū)有這些轉錄因子的結合位點。C/EBPβ屬于C/EBP轉錄因子家族成員之一，在其mRNA上有多個的開放讀碼框(ORF)和AUG起始密碼子位點，能夠翻譯出3種不同的蛋白亞型，分別為38 ku的LAP*、35 ku的LAP以及20 ku的LIP。其中，2個LAP因同時含有N末端轉錄活性結構域、DNA結合結構域和C末端bZIP結構域而屬于轉錄激活因子；LIP只含有DNA結合結構域和bZIP結構域而缺乏轉錄活性結構域，屬于轉錄抑制因子，不具備轉錄活性。本研究顯示，LPA能夠時間-濃度依賴性升高人肝癌Huh7細胞C/EBPβ的mRNA轉錄和其2個LAP蛋白亞型的水平，進而上調COX-2表達、促進細胞增殖。有研究報道抗炎藥物SIN能夠通過抑制軟骨細胞的炎癥相關因子COX-2、iNOS、TNF-α和IL-6表達改善小鼠骨關節(jié)炎。本研究表明,SIN能夠抑制人肝癌Huh7細胞中LPA所誘導的C/EBPβ、COX-2表達和細胞增殖。