劉 含，楊紅蘭，莫 晶，張 鵬，范安然，何志旭

K562細(xì)胞最初源于一位慢性髓系白血病患者的腹水，該細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)與胚胎期紅系祖細(xì)胞相近，是分析紅白血病耐藥性及γ-珠蛋白表達(dá)調(diào)控的常用細(xì)胞系。國內(nèi)外大量體外實(shí)驗(yàn)研究均顯示，K562不僅可以被誘導(dǎo)向紅系分化，還能在佛波酯誘導(dǎo)作用下向單核巨噬細(xì)胞系分化。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明K562在體外相對(duì)于造血干細(xì)胞是更易研究紅系相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)載體。丁酸鈉、Hemin及DMSO處理K562的作用效果均有較多的研究和報(bào)道，但這3種化合物對(duì)反映紅系分化指標(biāo)的作用差異卻少有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)旨在檢測化學(xué)試劑丁酸鈉、Hemin及DMSO在誘導(dǎo)K562紅系分化過程中，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、TMB染色陽性率以及紅細(xì)胞分化抗原CD235a表達(dá)量的不同影響。進(jìn)一步綜合評(píng)價(jià)丁酸鈉、Hemin及DMSO之間誘導(dǎo)K562紅系分化最佳的試劑，以期節(jié)省體外K562紅系分化誘導(dǎo)過程中選擇誘導(dǎo)試劑的時(shí)間，為紅系系統(tǒng)疾病如：地中海貧血，鐮刀狀細(xì)胞貧血，血紅蛋白異常綜合征等發(fā)病機(jī)制研究及藥物治療等體外研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

K562(武漢普諾賽公司)；Hemin、DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；丁酸鈉、TMB(美國Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司)；PBS、雙抗(以色列Biological Industries公司)；30% HO、冰醋酸(重慶川東化工有限公司)；NaOH(重慶江川化工有限公司)；HCl(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Quick-RNA miniprep plus(美國Zymo Research公司)；PI/RNase Staining Buffer(美國BD公司)；Donkey anti mouse 488(美國Thermo Fisher scientific公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與凍存

K562完全培養(yǎng)基成分為：RPMI 1640+10% FBS+1%雙抗；培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃，5% CO。丁酸鈉、Hemin及DMSO的工作濃度分別為1.5、20 μmol/L及2%，于6孔板中培養(yǎng)并每24 h連續(xù)培養(yǎng)換液120 h。K562細(xì)胞凍存條件為90%完全培養(yǎng)基+10% DMSO。

1.4 TMB染色

稱取TMB 5 mg，加入12.5 ml 1%冰醋酸并混勻，4 ℃避光保存。每24 h收集部分細(xì)胞并用PBS洗滌，而后新鮮配制1 ml TMB+5 μl 30% HO混合液，加入與細(xì)胞懸液等體積的染液，混勻后轉(zhuǎn)移至24孔板中，避光染色5 min。于×400下按“右下右上”的方向計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中胞質(zhì)成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算成百分率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

收集細(xì)胞并用PBS洗滌，將細(xì)胞沉淀用75%冰乙醇重懸，4 ℃保存16 h，離心并用PBS洗滌細(xì)胞2遍，而后用100 μl PI染液重懸避光染色10 min，分批染色保證樣本之間染色時(shí)間相同。經(jīng)200目篩過濾后上機(jī)檢測細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測CD235a的表達(dá)

收集藥物處理120 h的細(xì)胞，分為DMSO處理、丁酸鈉處理、Hemin處理、空白對(duì)照及單染二抗對(duì)照組。收集細(xì)胞并用50 μl PBS重懸，與50 μl含有0.5 μg CD235a的一抗稀釋液混勻，冰上孵育1 h，PBS洗滌2遍后，用配好的100 μl Donkey anti mouse 488(1 ∶200)重懸細(xì)胞，避光冰上孵育1 h。PBS洗滌并重懸，200目篩過濾后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

K562在添加有丁酸鈉、Hemin及DMSO的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)120 h，結(jié)果顯示，相比于空白對(duì)照組，丁酸鈉處理組K562的細(xì)胞數(shù)量持續(xù)受到抑制作用；DMSO處理組于48～72 h對(duì)K562細(xì)胞增殖表現(xiàn)為抑制，但處理96～120 h的細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hemin處理組細(xì)胞增殖與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物暴露120 h后，丁酸鈉、Hemin、DMSO處理及空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量分別為(1.72±0.15)×10個(gè)、(5.08±0.54)×10個(gè)、(4.83±0.8)×10個(gè)及(5.63±0.14)×10個(gè)，

F

=105.4。如圖1所示，丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制程度排序：丁酸鈉處理組>DMSO處理組>Hemin處理組≈空白對(duì)照組。

圖1 丁酸鈉、Hemin及DMSO處理K562后對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較：*P<0.05

2.2 丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

收集48、72 、96 及120 h丁酸鈉、Hemin及DMSO誘導(dǎo)的K562細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。圖2顯示Hemin處理的K562細(xì)胞周期相較空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)K562暴露于丁酸鈉48～72 h時(shí)，其細(xì)胞周期較空白對(duì)照組于G0/G1期比例增高；而隨著暴露時(shí)間的延長，處理96～120 h的細(xì)胞相對(duì)于空白對(duì)照組于G2/M期比例增高。與此同時(shí)，DMSO處理后K562細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。G0/G1期與空白對(duì)照組相比：

F

(48 h)=8.674；

F

(72 h)=37.82；

F

(96 h)=16.55；

F

(120 h)=32.81；G2/M期與空白對(duì)照組相比：

F

(96 h)=9.793；

F

(120 h)=24.53。

2.3 丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞TMB陽性率的影響

TMB染液可與胞內(nèi)的血紅蛋白發(fā)生氧化還原反應(yīng)，陽性染色呈深藍(lán)色。如圖3A所示，通過觀察120 h各組TMB染色陽性情況，可見Hemin和丁酸鈉處理后的細(xì)胞TMB陽性率高于空白對(duì)照組。每24 h收集部分細(xì)胞進(jìn)行TMB染色，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3B所示：相較于空白對(duì)照組，除DMSO處理組細(xì)胞TMB陽性比率從24～120 h均與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，丁酸鈉和Hemin處理后，K562的TMB陽性率48～120 h均高于空白對(duì)照組。藥物暴露120 h后，丁酸鈉、Hemin、DMSO處理及空白對(duì)照組TMB陽性率分別為(22.02±2.27)%、(90.83±2.69)%、(1.84±0.48)%及(2.89±0.18)%，

F

=1 641。

2.4 丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞CD235a表達(dá)的影響

收集丁酸鈉、Hemin及DMSO處理120 h后的細(xì)胞，洗滌并進(jìn)行CD235a染色，分別設(shè)置處理組包括丁酸鈉、Hemin及DMSO；空白對(duì)照及單染二抗對(duì)照組，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，選取其中1次，結(jié)果如圖4所示。DMSO處理組的CD235a較空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丁酸鈉和Hemin處理后，K562中CD235a表達(dá)水平均較空白對(duì)照組升高，且兩處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

國內(nèi)外大量研究顯示K562細(xì)胞具有向紅系和單核巨噬系分化的潛能。20世紀(jì)70年代研究表明,丁酸鈉、Hemin及DMSO被證明可誘導(dǎo)K562向紅系分化，但是這些化學(xué)試劑誘導(dǎo)得到的紅系細(xì)胞質(zhì)量和誘導(dǎo)效率等存在一定的差異。本研究通過分析丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)反映K562細(xì)胞紅系分化效率指標(biāo)的作用差異，綜合比較這3種試劑中誘導(dǎo)K562紅系分化效率較好的試劑，為之后紅細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

Hemin的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示其分子內(nèi)部含有一個(gè)Fe，常被臨床用作補(bǔ)鐵劑。紅細(xì)胞分化發(fā)育過程中，鐵離子是紅細(xì)胞合成血紅蛋白必不可少的離子，K562培養(yǎng)液中Hemin的加入從外源大幅提高了血紅蛋白合成的原料，這可被認(rèn)為是其誘導(dǎo)K562紅系分化的原理之一。同時(shí)有研究表明Hemin在誘導(dǎo)紅系分化過程中，對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用的分子G蛋白和磷酸化的ERK表達(dá)水平的升高。隨著Hemin處理時(shí)間的延長，胎兒血紅蛋白的表達(dá)量往往呈上調(diào)變化。然而這種作用在去除誘導(dǎo)劑后便恢復(fù)到未誘導(dǎo)之前的狀態(tài)，呈可逆性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hemin處理后K562細(xì)胞TMB陽性比率較空白對(duì)照組高。但受Hemin自身化學(xué)性質(zhì)的影響，可能導(dǎo)致TMB陽性比率假性升高。為了克服這種問題，本研究通過使用紅系表面標(biāo)記CD235a進(jìn)一步檢測誘導(dǎo)后的紅細(xì)胞分化比例。CD235a是用來區(qū)分紅系祖細(xì)胞和紅系終末期細(xì)胞常用的紅系細(xì)胞表面標(biāo)志物。隨著K562向紅系分化發(fā)展，其表面的CD235a表達(dá)也會(huì)隨之增高。本研究發(fā)現(xiàn)，Hemin處理K562細(xì)胞后，CD235a陽性細(xì)胞比率均高于空白對(duì)照組和DMSO組。并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hemin的處理并不影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。以上結(jié)果表明Hemin可有效的誘導(dǎo)K562向紅系分化。

圖2 丁酸鈉、Hemin及DMSO處理120 h對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

圖3 丁酸鈉、Hemin和DMSO處理K562后TMB陽性率的變化

圖4 丁酸鈉、Hemin及DMSO對(duì)K562細(xì)胞CD235a表達(dá)的影響

除Hemin外，DMSO也被報(bào)道可誘導(dǎo)K562向紅系分化。但是，本研究通過TMB染色和CD235a染色發(fā)現(xiàn)，DMSO的處理并不能大幅增加紅系細(xì)胞的比例。且在誘導(dǎo)過程中，DMSO可以改變細(xì)胞周期。因此，DMSO在K562細(xì)胞誘導(dǎo)紅系分化中并不是非常好的選擇。

丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸，具有抑制組蛋白去乙酰基酶發(fā)揮作用的特性，可促進(jìn)K562向紅系分化。丁酸鈉誘導(dǎo)K562紅系分化的作用機(jī)理不僅依靠自身特性，作用于γ-珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)使其乙酰化程度升高，同時(shí)有研究顯示丁酸鈉還可通過激活p38 MAPK信號(hào)途徑促進(jìn)γ-珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)乙?；潭?。本研究通過TMB染色和CD235a表面標(biāo)記染色顯示丁酸鈉能夠有效的促進(jìn)K562細(xì)胞向紅系分化，但在丁酸鈉處理過程中可能通過改變細(xì)胞周期，從而對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用。因此，在需要獲得大量的誘導(dǎo)的紅系細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，丁酸鈉也不是非常好的選擇。