李曉娟，王 玨，何建萍，呂夢(mèng)欣，錢(qián) 源1,,,5,6,7

子癇前期(preeclampsia，PE)是嚴(yán)重威脅母兒健康的妊娠期特有疾病，可引起全身多系統(tǒng)功能失調(diào)。研究表明其發(fā)病機(jī)制可能與胎盤(pán)缺氧及灌注不良密切相關(guān)。子宮螺旋動(dòng)脈重注不良可引起胎盤(pán)侵襲功能不足，胎盤(pán)灌注減少，繼而導(dǎo)致PE的發(fā)生。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-cording，lncRNA)雖不編碼蛋白質(zhì)但可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾和表觀(guān)遺傳修飾等方式參與基因表達(dá)調(diào)控，研究表明lncRNA與滋養(yǎng)細(xì)胞功能及胎盤(pán)分化、發(fā)育密切相關(guān)。目前已報(bào)道PE胎盤(pán)中IGF2/H19、MEG3、HOTAIR等多種lncRNA異常表達(dá)。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是一種典型的lncRNA，目前研究表明其可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等功能參與多種腫瘤的發(fā)生。但HOTAIR與PE的發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)目前尚未闡明。

慢病毒是一類(lèi)從人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型(human immunodeficiency type I，HIV-Ⅰ)病毒上改造而成的病毒載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其可將自身的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并與宿主細(xì)胞染色體整合，達(dá)到目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)的目的。與質(zhì)粒及其他病毒載體相比，慢病毒具有感染效率高、轉(zhuǎn)移基因片段容量大(10 kb左右)、低免疫原性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，是攜帶目的基因的理想載體。該研究以慢病毒作為載體攜帶HOTAIR基因入HTR-8/Svneo細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)HOTAIR在人滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)。為進(jìn)一步探討HOTAIR在人滋養(yǎng)細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制提供有力的支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，HTR-8/SVneo細(xì)胞購(gòu)自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，DMEM、RMPI-1640培養(yǎng)基、胰酶Trypsin-EDTA Solution、雙抗(青鏈霉素)(美國(guó)gibco公司)，HOTAIR引物、RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Polybrene(德國(guó)Sigma公司)。NotI和BamHI、DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA marker(加拿大Fermentas公司)。ClonExpressEntry One Step Cloning Kit (南京諾唯贊生物科技有限公司)，瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化有限公司)，中量抽提試劑盒(杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)。10 cm培養(yǎng)皿、96孔板、50 ml離心管(美國(guó)Corning公司)，過(guò)濾器(德國(guó)Sartorius Stedim公司)。

1.2 方法

1.2.1

HOTAIR過(guò)表達(dá)重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)HOTAIR基因全序列設(shè)計(jì)PCR引物并在上下游分別加上NotI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，同樣方法設(shè)計(jì)無(wú)義序列NC組引物。通過(guò)2輪PCR反應(yīng)獲得目的基因相應(yīng)的目的片帶。片段利用EcoRV克隆到pUC57中，測(cè)序驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆。并用ClonExpressEntry One Step Cloning Kit，將擴(kuò)增好的片段重組克隆到線(xiàn)性化的LV5載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液接種到LB瓊脂培養(yǎng)基(含50 mg/L氨芐青霉素)上，37 ℃溫箱倒置培養(yǎng)16 h。挑取克隆菌落用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒并用NotI和BamHI對(duì)目的基因及LV5載體進(jìn)行雙酶切鑒定，對(duì)鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達(dá)質(zhì)粒載體，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。

1.2.2

慢病毒包裝、收集及滴度檢測(cè)

將重組慢病毒質(zhì)粒LV5-HOTAIR與穿梭質(zhì)粒A032和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol)經(jīng)RNAi-mate共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將上清液4 000 r/min，離心4 min后用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾收集病毒濃縮液，通過(guò)熒光顯微鏡應(yīng)用倍比稀釋法檢測(cè)病毒的滴度。

1.2.3

過(guò)表達(dá)HOTAIR慢病毒感染及穩(wěn)定株篩選

選取P3～P6代HTR-8/Svneo細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，加入HOTAIR慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)分組為Control、HOTAIR-NC及HOTAIR不同感染復(fù)數(shù)(MOI)組：HOTAIR-1、HOTAIR-2、HOTAIR-4、HOTAIR-8組。轉(zhuǎn)染24 h后換液，72 h后熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)情況并收集各組細(xì)胞用qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR表達(dá)水平，以確定病毒最佳感染復(fù)數(shù)。將HOTAIR組及HOTAIR-NC組慢病毒在最佳感染復(fù)數(shù)濃度下轉(zhuǎn)染HTR-8/Svneo細(xì)胞，用含有終濃度為1 μg/ml嘌呤霉素(預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選的最佳濃度)的培養(yǎng)基傳代篩選HOTAIR穩(wěn)定株，穩(wěn)定株經(jīng)傳3代后熒光顯微鏡觀(guān)察GFP的表達(dá)情況并收集細(xì)胞經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR表達(dá)情況。

1.2.4

qRT

-

PCR檢測(cè)HOTAIR

mRNA的表達(dá)

用TRIzol收集細(xì)胞，提取總RNA，用酶標(biāo)儀RNA進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。以基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參。HOTAIR引物序列: F: 5′-CAAACAGAGTCCGTTCAGTGTC-3′；R: 5′-TTCTTAAATTGGGCTGGGTC-3′。β-actin引物序列: F: 5′- AAACGTGCTGCTGACCGAG-3′；R: 5′- TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃、3 min；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s(40個(gè)循環(huán))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以2進(jìn)行基因表達(dá)的相對(duì)定量，確定過(guò)表達(dá)效率。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒鑒定

重組慢病毒質(zhì)粒LV5-HOTAIR經(jīng)NotI和BamHI雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果重組質(zhì)粒酶切后可觀(guān)察到一條2 000～2 500 bp的目的條帶(圖1)，電泳結(jié)果與理論值2 364 bp相符。重組質(zhì)粒送測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的目的片段與HOTAIR基因序列完全一致，無(wú)堿基突變以及堿基插入、缺失等異常(圖2)，表明HOTAIR慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒NotI和BamHI雙酶切鑒定圖片

圖2 重組慢病毒質(zhì)粒HOTAIR插入片段的部分測(cè)序圖譜

2.2 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果及熒光顯微鏡下綠色熒光表達(dá)情況

HOTAIR慢病毒的滴度為1×10TU/ml，HOTAIR-NC慢病毒的滴度為2×10TU/ml。轉(zhuǎn)染慢病毒后的HTR-8/Svneo細(xì)胞用含有終濃度為1 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基傳代篩選HOTAIR穩(wěn)定株，嘌呤霉素篩選3代后細(xì)胞幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象，表明剩余的細(xì)胞均是含有嘌呤抗性的細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀(guān)察過(guò)表達(dá)HOTAIR組與NC組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)(圖3)。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR表達(dá)情況

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：① 不同感染復(fù)數(shù)的慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，HOTAIR組HOTAIR表達(dá)比Control組及HOTAIR-NC組均升高，MOI為4時(shí)HOTAIR表達(dá)水平最高，選擇這個(gè)濃度為后續(xù)轉(zhuǎn)染條件(圖4)。② 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOTAIR組HOTAIR表達(dá)量是Control組的206.3倍(

t

=196.9，

P

<0.05)，是HOTAIR-NC組的232.8倍(

t

=197.6，

P

<0.05)HOTAIR穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功(圖5)。

3 討論

PE與胎盤(pán)功能障礙密切相關(guān)，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不佳，導(dǎo)致胎盤(pán)缺血，進(jìn)而促進(jìn)血管活性因子的釋放、血管內(nèi)皮功能障礙引起PE的發(fā)生?？梢?jiàn)胎盤(pán)功能障礙在PE發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前研究表明HOTAIR在PE胎盤(pán)中表達(dá)異常，HOTAIR與胎盤(pán)功能障礙密切相關(guān)。Mohammadpour-Gharehbagh et al發(fā)現(xiàn)母體外周血及胎盤(pán)HOTAIR rs10783618多態(tài)性變化可能增加PE易感性。Zhang et al發(fā)現(xiàn)PUM1與HOTAIR結(jié)合后降低HOTAIR的半衰期，降低HOTAIR的穩(wěn)定性，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制下調(diào)HOTAIR的表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力參與PE的發(fā)生。但HOTAIR與PE發(fā)病機(jī)制的研究仍相對(duì)不足，為進(jìn)一步研究HOTAIR對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能影響及下游具體的機(jī)制，本課題組構(gòu)建了HOTAIR過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)慢病毒包裝提高其轉(zhuǎn)染效率，并篩選出穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的HTR-8/SVneo細(xì)胞株。

此次研究只構(gòu)建了HOTAIR過(guò)表達(dá)載體后續(xù)將進(jìn)一步完善HOTAIR抑制載體的構(gòu)建。下一步擬探討HOTAIR對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，及對(duì)胎盤(pán)功能相關(guān)信號(hào)通路的影響。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了HOTAIR慢病毒過(guò)表達(dá)載體，為后續(xù)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)提供良好基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究提供可行性。為進(jìn)一步探討HOTAIR功能及其在PE發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖3 熒光顯微鏡下觀(guān)察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOTAIR、HOTAIR-NC慢病毒的HTR-8/Svneo細(xì)胞 ×200

圖4 qRT-PCR檢測(cè)不同感染復(fù)數(shù)HOTAIR慢病毒轉(zhuǎn)染HTR-8/Svneo細(xì)胞后HOTAIR表達(dá)水平

圖5 qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HTR-8/Svneo細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平