張 濤，陳 強(qiáng)，杜衛(wèi)東，吳正升

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界癌癥相關(guān)死亡的四大死亡原因之一，也是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。盡管目前外科手術(shù)、消融治療等技術(shù)日益發(fā)展，但由于腫瘤復(fù)發(fā)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致HCC患者的5年生存率仍然很低。因此，探索肝癌生物學(xué)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)尋找新的治療靶點(diǎn)以改善目前HCC的治療方式有著重要意義。前列腺跨膜雄激素誘導(dǎo)蛋白1(prostate transmembrane protein，androgen induced 1，PMEPA1)是一種I b 型膜蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)主要定位于溶酶體膜、核內(nèi)體膜和高爾基復(fù)合體膜上。PMEPA1最初是在前列腺中被發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)為雄激素誘導(dǎo)上調(diào)基因。相關(guān)研究表明，PMEPA1在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種類(lèi)型腫瘤中呈高度表達(dá)，因此，PMEPA1也被稱(chēng)為實(shí)體腫瘤相關(guān)基因1(solid tumor associated gene 1，STAG1)。PMEPA1對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的影響及作用機(jī)制目前尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA沉默PMEPA1在肝癌細(xì)胞株HepG2中的表達(dá)，并分析對(duì)其增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步探討HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 2014年1月—2018年12 月HCC石蠟包埋標(biāo)本112例，癌旁非腫瘤肝組織石蠟包埋標(biāo)本86例。所有結(jié)果均由2位病理科醫(yī)師采用雙盲原則進(jìn)行評(píng)判且所有患者并未進(jìn)行術(shù)前放化療。從UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索數(shù)據(jù)，其中正常肝組織50例，HCC組織371例。人肝癌細(xì)胞株HepG2(美國(guó) ATCC 細(xì)胞庫(kù)); 鼠抗人β-actin抗體、兔抗人PMEPA1抗體(武漢三鷹生物公司); RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(北京全式金生物公司)； Transwell小室、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、0.25%胰蛋白酶、蛋白裂解液(上海碧云天生物公司)；無(wú)血清培養(yǎng)基 OPTI-MEM、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)(美國(guó) GIBCO 公司)；免疫組化使用通用型 EnVision 兩步法試劑盒及 DAB 顯色劑(北京中杉金橋公司)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，同時(shí)以 PBS 緩沖液作為陰性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1

免疫組化染色 HCC組織及正常肝組織標(biāo)本使用福爾馬林溶液(10%)固定，石蠟包埋，切成約4 μm 的連續(xù)切片,采用EnVision 兩步法對(duì)肝癌及正常肝組織中PMEPA1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2

結(jié)果判定 將免疫組化染色強(qiáng)度分為以下3類(lèi)： 0 分：細(xì)胞無(wú)著色； 1 分：細(xì)胞著色為淡黃色；2 分：細(xì)胞著色為深棕色： 3分。同時(shí)將陽(yáng)性細(xì)胞百分比分值分為以下4類(lèi): 0 分： 無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1 分： 陽(yáng)性細(xì)胞 ≤ 20%； 2 分： 陽(yáng)性細(xì)胞 21%～50%；3 分： 陽(yáng)性細(xì)胞 51%～75%；4 分： 陽(yáng)性細(xì)胞 >75%。最終將染色強(qiáng)度分值與陽(yáng)性細(xì)胞百分比分值相乘得出結(jié)果并分為以下3組： 0 分：陰性組；1～4分：低表達(dá)組；6～12分：高表達(dá)組。

1.2.3

細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素)并放置于37 ℃，含有5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d后更換培養(yǎng)基，若細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)，則進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.4

轉(zhuǎn)染siRNA

購(gòu)買(mǎi)PMEPA1 的 siRNA ( siPMEPA1和siPMEPA2) 和陰性對(duì)照(NC) (上海吉瑪生物公司)。siRNA序列如下: siPMEPA1上游：5′-GCAACUGCAAACGCUCUUUTT-3′；siPMEPA1下游：5′-AAAGAGCGUUUGCAGUUGCTT-3′；siPMEPA2上游：5′-GAGCAAAGAGAAGGAUAAATT-3′；siPMEPA2下游：5′-UUUAUCCUUCUCUUUGCUCTT-3′；NC上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；NC下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將購(gòu)買(mǎi)的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)傳代后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，平均6孔板每孔接種2×10個(gè)細(xì)胞密度進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 3000的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染siPMEPA1和NC后收集細(xì)胞，然后采用Western blot及qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5

收取蛋白進(jìn)行Western

blot檢測(cè) 收集待檢測(cè)細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，使用10% SDS-PAGE 凝膠電泳，在恒流300 mA，轉(zhuǎn)90 min的條件下轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再使用5% 牛奶封閉1 h，隨后使用一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2天使用PBST溶液洗膜后孵育二抗1 h后，再次使用PBST溶液進(jìn)行洗滌，最后加入顯影液進(jìn)行曝光并采集圖像，結(jié)果進(jìn)行灰度分析后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.6

qRT

-

PCR檢測(cè) 收集細(xì)胞，先使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，再使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。在預(yù)變性95 ℃、40 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、57 s，95 ℃、15 s下完成，退火后采集熒光信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行副孔，取平均值后并將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)出Excel，并繪制柱狀圖。GAPDH引物序列如下：上游:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PMEPA1引物序列如下： 上游：5′-GTCTGCACGGTCCTTCATCAGC-3′；下游：5′-GCACTATCCATCAGGTCACTGTCG-3′。以上引物序列均由上海生工公司合成。

1.2.7

MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 先用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)使用96孔板，每孔接種HepG2細(xì)胞1×10個(gè)，每1組設(shè)置6個(gè)平行副孔，連續(xù)測(cè)定5 d。檢測(cè)時(shí)，現(xiàn)將96孔板中的培養(yǎng)基棄去，待測(cè)孔每孔加入100 μl 混合液(MTT液與培養(yǎng)基按1 ∶9比例混合)后放置于37 ℃ 溫箱孵育2 h，棄去混合液后待測(cè)孔每孔加入100 μl DMSO并置于搖床上避光搖25 min。最后使用酶標(biāo)儀測(cè)檢測(cè)OD570，得出數(shù)值取平均值后作圖。

1.2.8

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 先用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。Migration實(shí)驗(yàn)使用24孔板，每孔先加入800 μl的含有FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上方置入Transwell 小室，小室中加入總體積200 μl的無(wú)血清重懸的細(xì)胞5×10個(gè)，放置于37 ℃溫箱6 h 后，拿出小室。使用1×PBS溶液清洗小室內(nèi)壁，再用90%的乙醇固定30 min后使用0.1% 結(jié)晶紫染色15 min。染色結(jié)束后，用細(xì)水流清洗小室內(nèi)壁，用棉簽清除剩余的結(jié)晶紫。每組隨機(jī)選取3個(gè)視野在熒光倒置顯微鏡下觀察后計(jì)數(shù)并作圖。

1.2.9

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)

根據(jù)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)中RNA-seq和肝癌類(lèi)型的臨床數(shù)據(jù)，分析PMEPA1 mRNA在人肝正常組織和HCC組織中的表達(dá)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，作圖。

2 結(jié)果

2.1 PMEPA1在正常肝組織及HCC中的表達(dá)

通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)在50例正常肝組織和371例HCC組織中PMEPA1的表達(dá)，結(jié)果顯示：HCC組織中PMEPA1表達(dá)的中位值高于正常肝組織(

P

<0.01，見(jiàn)圖1)。通過(guò)免疫組化染色方法，檢測(cè)112例HCC組織以及86例肝正常組織PMEPA1蛋白表達(dá)，結(jié)果表明PMEPA1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，以彌漫均質(zhì)淡黃色至棕褐色顆粒作為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取 5 個(gè)高倍視野觀察，采用半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷。免疫組化結(jié)果顯示PMEPA1蛋白在HCC組織呈陽(yáng)性反應(yīng)，見(jiàn)圖2，與正常肝組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=28.94，

P

<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 PMEPA1在正常肝組織及HCC組織中的表達(dá) 與正常肝組織比較：**P<0.01

圖2 檢測(cè)PMEPA1在不同肝組織中的表達(dá)狀況 DAB×100

表1 PMEPA1 在HCC組織和正常肝組織中表達(dá) [n(%)]

2.2 PMEPA1蛋白在HCC組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的的關(guān)系

通過(guò)分析112例HCC組織與86例正常肝組織的臨床病理參數(shù)，發(fā)現(xiàn)PMEPA1蛋白表達(dá)與患者腫瘤直徑(χ=4.369 8，

P

<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(χ=4.406 9，

P

<0.05) ，但與患者性別、年齡、AFP 水平高低、脈管浸潤(rùn)、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期均無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 PMEPA1在肝癌組織中的表達(dá)與臨床病理 特征的關(guān)系 [n(%)]

2.3 PMEPA1在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

隨后檢測(cè)PMEPA1在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)染PMEPA1特異性的 siRNA后，應(yīng)用qRT-PCR 檢測(cè)PMEPA1的 mRNA 水平表達(dá)。與NC組相比， PMEPA1-siRNA 組中的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，NC組與PMEPA1-siRNA 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=76.06,

P

<0.01)，見(jiàn)圖3A。同時(shí)通過(guò)Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示: PMEPA1-siRNA 組的PMEPA1的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=144.9,

P

<0.01)，見(jiàn)圖3B。

2.4 下調(diào)PMEPA1對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

使用已轉(zhuǎn)染siPMEPA1的HepG2細(xì)胞，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PMEPA1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，第5天siPMEPA1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖低于NC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=163.5,

P

<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染siPMEPA1后PMEPA1表達(dá)量

圖4 使用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染siPMEPA1后對(duì) HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

a:NC組;b:PMEPA1-siRNA1組;c: PMEPA1-siRNA2組;與NC組比較：

P

<0.01

2.5 下調(diào)PMEPA1抑制HepG2細(xì)胞遷移

使用上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PMEPA1對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10倍鏡下觀察，與NC組相比，PMEPA1-siRNA1組和PMEPA1-siRNA2組細(xì)胞的遷移能力降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=161.3,

P

<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 使用Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siPMEPA1后對(duì) HepG2細(xì)胞遷移的影響

3 討論

PMEPA1基因定位于人染色體20q13.31～q13.33。該基因長(zhǎng)度約為 62 kb，含有5個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。PMEPA1對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor β， TGF-β)起到誘導(dǎo)作用，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal-transition，EMT)過(guò)程，EMT是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移的重要生物學(xué)過(guò)程，而TGF-β在EMT的發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。同時(shí)，TGF-β可作為胚胎和癌癥發(fā)展的重要調(diào)節(jié)劑，與細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和遷移密切相關(guān)。

本研究首先通過(guò)檢索UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)371例HCC組織以及50例正常肝組織PMEPA1表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：HCC組織中PMEPA1表達(dá)中位值明顯高于正常肝組織(

P

<0.01)。通過(guò)免疫組化染色方法，檢測(cè)112例HCC組織以及86例肝正常組織，表明PMEPA1蛋白定位于HCC細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫均質(zhì)淡黃色至棕褐色顆粒狀。與肝正常組織內(nèi)PMEPA1表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。另外，HCC組織內(nèi)PMEPA1蛋白表達(dá)與腫瘤大小(

P

=0.036 6)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(

P

=0.035 8)密切相關(guān)。與性別、年齡、AFP 水平高低、脈管浸潤(rùn)、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期均無(wú)相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)PMEPA1- siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系HepG2的 PMEPA1蛋白及其mRNA表達(dá)均下調(diào)(

P

<0.01)。 siPMEPA1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞增殖能力以及轉(zhuǎn)染 siPMEPA1 HepG2細(xì)胞遷移能力均明顯降低 (

P

<0.01)，這一現(xiàn)象說(shuō)明PMEPA1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。其作用機(jī)制目前尚不明了。推測(cè)潛在的分子生物學(xué)機(jī)制包括：① PMEPAI通過(guò)促進(jìn)TGF-β受體溶酶體降解抑制TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，影響著肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移；② PMEPA1通過(guò)抑制Smad3/4-c-Myc-p21 Cip1信號(hào)通路促進(jìn)雄激素受體陰性的前列腺癌細(xì)胞增殖；③ PMEPA1分子受經(jīng)典TGF-β/Smad信號(hào)途徑的作用發(fā)生顯著上調(diào),沉默PMEPA1的表達(dá)能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力,并使細(xì)胞形態(tài)由間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)變。