韓成美，柳 梅，任維鑫，朱英斌，陳茂麗

微小RNA(microRNA, miRNA)被報(bào)道通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-485-5p在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常，在膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)減少，可抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。miR-485-5p抑制肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的增殖和遷移侵襲能力。性別決定區(qū)Y框蛋白5(sex determinant Y box protein 5, SOX5)在HCC中促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，SOX5在HCC中是否發(fā)揮其它的生物學(xué)作用，以及SOX5是否作為miR-485-5p的靶基因參與HCC的發(fā)生發(fā)展引起課題組的關(guān)注，該文對(duì)此及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在獲得miR-485-5p作為HCC治療潛在靶點(diǎn)的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集2018年6月—2019年10月入住山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟(jì)南人民醫(yī)院行手術(shù)治療的HCC患者的癌組織和癌旁組織，癌旁組織為距離腫瘤組織邊緣3 cm以上的非癌肝組織，癌組織和癌旁組織均經(jīng)病理專家確認(rèn)。要求收集臨床樣本為首次行手術(shù)切除的病灶，并在術(shù)前未經(jīng)放化療等任何形式的治療。將切除的PTC及癌旁組織立即凍存于-80 ℃液氮中。所有患者簽署知情同意書，本研究由本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑材料

TRIzol試劑和qRT-PCR Kit試劑盒購自日本TaKaRa公司；Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒購自上海DBIBioscience公司；miR-485-5p、SOX5、內(nèi)參U6和β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HCC細(xì)胞Huh7購自上海中國(guó)科學(xué)院；高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal Bovine Serum, FBS)和胰酶購自美國(guó)Hyclone公司；pGL6-TA-SOX5-野生型質(zhì)粒(SOX5-wt)、pGL6-TA-SOX5-突變型質(zhì)粒(SOX5-mut)、miR-485-5p mimic和過表達(dá)SOX5質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司；雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶試劑有限公司；CCK8試劑購自日本同仁化學(xué)；Transwell小室購自美國(guó)coring公司；蛋白裂解液和BCA檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo公司；PVDF膜購自邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司；pAkt(66444-1-Ig，1 ∶2 000)抗體購自美國(guó)proteintech公司和pGSK3β(ab75814，1 ∶1 000)抗體購自英國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

Huh7快速復(fù)蘇后立即重懸至高糖培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS濃度為10%。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO的全濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，以每孔1×10個(gè)細(xì)胞傳至6孔板中，分為NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組。細(xì)胞接種12 h后采用lip2000進(jìn)行各組轉(zhuǎn)染，無關(guān)序列對(duì)照轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞，miR-485-5p 模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic組細(xì)胞，miR-485-5p mimic和過表達(dá)SOX5質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic+oe-SOX 5組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR

HCC組織研磨成粉末后，加入TRIzol試劑，冰上完全裂解，提取組織中的總RNA。Huh7細(xì)胞長(zhǎng)滿后，PBS洗1遍，加入TRIzol試劑，提取細(xì)胞中總RNA。測(cè)得RNA的濃度和純度后。按照85 ℃、5 s，37 ℃、15 min反應(yīng)條件采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照95 ℃預(yù)變性5 s，40個(gè)95 ℃變性5 s、65 ℃退火延伸34 s反應(yīng)條件，采用qRT-PCR試劑盒體系測(cè)得各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，按照2公式以U6為內(nèi)參計(jì)算HCC組織和細(xì)胞中miR-485-5p的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算SOX5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。miR-485-5p引物序列F: 5′-AGAGGCTGGCCGTGATG-3′, R: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。SOX5引物序列F: 5′-CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG-3′, R: 5′-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3′。U6引物序列F: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, R: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。β-actin引物序列F: 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′, R: 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

TargetScan7.1在線軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-485-5p可能的靶基因。以1.4中的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增包含miR-485-5p結(jié)合位點(diǎn)的SOX 5 3'UTR片段，SOX5引物進(jìn)行SOX5基因片段擴(kuò)增，采用XbaI和XhoI雙酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增的SOX5片段插入到pGL6-TA質(zhì)粒中熒光素酶基因的下游，獲得pGL6-TA-SOX5-野生型質(zhì)粒(SOX5-wt)。以同樣的方法將突變片段插入到pGL6-TA質(zhì)粒中，獲得pGL6-TA-SOX5-野生型質(zhì)粒(SOX5-wt)。Huh7細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)傳至96孔板中，分為NC+SOX5-wt組(無關(guān)序列對(duì)照與SOX5-wt質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染)、miR-485-5p+SOX5-wt組(miR-485-5p mimic與SOX5-wt質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染)、NC+SOX5-mut組(無關(guān)序列對(duì)照與SOX5-mut質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染)、miR-485-5p+SOX5-mut組(miR-485-5p mimic與SOX5-mut質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染)，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按照雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

Huh7細(xì)胞長(zhǎng)滿后，PBS洗1遍，胰酶消化收集細(xì)胞，以每孔1 500個(gè)細(xì)胞傳至96孔板中，分為NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組，按上述轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染0、24、48和72 h時(shí)，每孔加入10 μl CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各樣品的吸光度值。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，無血清高糖培養(yǎng)基洗2次，以1×10個(gè)細(xì)胞重懸至100 μl無血清高糖培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液加入到Transwell小室中，并將Transwell小室放入加有500 μl含有10% FBS的完全培養(yǎng)基中。放置37 ℃、5% CO的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h左右終止培養(yǎng)，PBS將未穿過的細(xì)胞洗去后，甲醇固定細(xì)胞，蘇木精進(jìn)行染色，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜的個(gè)數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，PBS洗1遍后，加入蛋白裂解液，超聲裂解30 min，14 000 r/min、4 ℃離心30 min。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸蛋白變性。定量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白經(jīng)濕性轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA常溫孵育PVDF膜1 h，pAkt、pGSK3β 和內(nèi)參GAPDH一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，二抗稀釋液室溫孵育1 h，ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 miR-485-5p對(duì)SOX5的靶向調(diào)控作用

TargetScan 7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示SOX5的3′UTR與miR-485-5p具有結(jié)合位點(diǎn)，見圖1A。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC+SOX5-wt組相比，miR-485-5p+SOX5-wt組的熒光素酶活性降低(

t

=4.031,

P

=0.021)；而NC+SOX5-mut和miR-485-5p+SOX5-mut組間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=1.052,

P

=0.067)，見圖1B。

圖1 miR-485-5p對(duì)SOX5的靶向調(diào)控作用

2.2 miR-485-5p和SOX5在HCC組織中的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示與癌旁組織相比，HCC組織中miR-485-5p的表達(dá)降低(

t

=2.747,

P

=0.008)。與癌旁組織相比，HCC組織中SOX5 mRNA的表達(dá)增加(

t

=5.697,

P

<0.001)，見圖2。

2.3 miR-485-5p和SOX5在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性

采用Pearson線性相關(guān)分析檢測(cè)HCC組織中miR-485-5p與SOX5的表達(dá)相關(guān)性，按照miR-485-5p在HCC組織中的平均相對(duì)表達(dá)量0.73為界，將40例HCC患者分為miR-485-5p高表達(dá)(18例)和miR-485-5p低表達(dá)(22例)。SOX5在HCC組織中的平均相對(duì)表達(dá)量1.43為界，將40例HCC患者分為SOX5高表達(dá)(19例)和SOX5低表達(dá)(21例)，結(jié)果顯示miR-485-5p與SOX5在HCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(

r

=-0.701，

P

=0.004)。

2.4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

Huh7轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic，與NC組相比，miR-485-5p mimic組中miR-485-5p的表達(dá)增加(

t

=6.331,

P

=0.010)，表明miR-485-5p mimic成功轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞，見圖3A。與NC組相比，miR-485-5p mimic組細(xì)胞中SOX5 mRNA的表達(dá)降低(

t

=4.050,

P

=0.018)，表明miR-485-5p負(fù)調(diào)控SOX5的表達(dá)，見圖3B。Huh7轉(zhuǎn)染SOX5過表達(dá)質(zhì)粒，與NC組相比，oe-SOX5組細(xì)胞中SOX5蛋白的表達(dá)增加(

t

=8.041,

P

<0.001)，見圖3C。表明SOX5過表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)miR-485-5p和SOX5在HCC組織中的表達(dá)水平

2.5 miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)HCC細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞活力降低。而與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞活力增加，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對(duì)HCC細(xì)胞活力的抑制作用。見圖4。

2.6 miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)HCC細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組Huh7細(xì)胞穿膜數(shù)為(128.33±10.57)個(gè)，miR-485-5p mimic組Huh7細(xì)胞穿膜數(shù)為(32.67±3.84)個(gè)，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞穿膜數(shù)為(64.33±9.78)個(gè)。與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞遷移侵襲能力降低(

t

=13.871,

P

<0.001；

t

=5.952,

P

=0.009)。與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞遷移侵襲能力增加(

t

=4.863,

P

=0.012)，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對(duì)HCC細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用。見圖5。

圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

圖4 miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)Huh7細(xì)胞活力的影響

圖5 miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)Huh7細(xì)胞遷移侵襲能力的影響 ×200

2.7 miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)Akt/GSK3β的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞中pAkt和pGSK3β蛋白表達(dá)降低。與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細(xì)胞中pAkt和pGSK3β蛋白表達(dá)增加，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對(duì)Akt/GSK3β信號(hào)通路的抑制作用。見圖6、表1。

圖6 miR-485-5p負(fù)靶向調(diào)控SOX5對(duì)Akt/GSK3β的影響

表1 各組細(xì)胞中Akt/GSK3β信號(hào)通路蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

miRNA是長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的一類小非編碼單鏈RNA分子，包括惡性腫瘤在內(nèi)的各種人類疾病中表達(dá)異常，并且被認(rèn)為是抗腫瘤治療的候選靶點(diǎn)。miR-485-5p位于14q32號(hào)染色體的人類基因組區(qū)域。miR-485-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-485-5p在結(jié)直腸癌中低表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。miR-485-5p的表達(dá)顯著抑制了食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。越來越多的證據(jù)集中在miR-485-5p在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能上，Gao et al報(bào)道m(xù)iR-485-5p在HCC中表達(dá)下調(diào)，并通過負(fù)調(diào)控WBP2抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miRNA通過與它們靶基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合來抑制其靶基因信使RNA的表達(dá)是miRNA發(fā)揮調(diào)控作用的重要機(jī)制，每個(gè)miRNA的靶基因可能存在成千上百個(gè)。TargetScan7.1軟件是可以在線預(yù)測(cè)miRNA與其靶基因結(jié)合位點(diǎn)的網(wǎng)站，本文在此網(wǎng)站上發(fā)現(xiàn)miR-485-5p與SOX5 mRNA的3'非翻譯區(qū)具有結(jié)合位點(diǎn)，并且采用雙熒光素酶報(bào)道基因證實(shí)SOX5為miR-485-5p的靶基因。

SOX5是SOX家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，具有高遷移率族DNA結(jié)合基序的保守序列，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和決定細(xì)胞命運(yùn)方面具有重要作用。SOX5的最新研究主要集中在腫瘤上，在胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和維持腫瘤干細(xì)胞干性等方面具有重要的作用。Wang et al報(bào)道SOX5在HCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。雙熒光素酶報(bào)道實(shí)驗(yàn)提示miR-485-5p可能通過調(diào)控SOX5在HCC中發(fā)揮作用。本文采用qRT-PCR檢測(cè)顯示與癌旁組織相比，HCC組織中miR-485-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，而SOX5的表達(dá)顯著上調(diào)，與已有的研究一致。但是person相關(guān)分析顯示，miR-485-5p與SOX5在HCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且采用mimic轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞過表達(dá)miR-485-5p后顯示HCC細(xì)胞中SOX5 mRNA的表達(dá)降低，表明miR-485-5p靶向負(fù)調(diào)控SOX5。采用MTS和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-485-5p調(diào)控SOX5在HCC中的生物學(xué)功能，結(jié)果表明與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組HCC細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力降低，而與miR-485-5p mimic組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組HCC細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力增加，表明miR-485-5p通過負(fù)調(diào)控SOX5抑制HCC的細(xì)胞的惡性表型。為了進(jìn)一步研究miR-485-5p調(diào)控SOX5發(fā)揮作用的機(jī)制，本文采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-485-5p調(diào)控SOX5對(duì)Akt/GSK3β信號(hào)通路的影響，Akt/GSK3β信號(hào)通路是與腫瘤增殖和侵襲遷移能力相關(guān)的腫瘤重要調(diào)控途徑，包括HCC。Akt/GSK3β信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Akt和GSK3β發(fā)生磷酸化激活(pAkt和pGSK3β)促使其下游信號(hào)分子發(fā)生促腫瘤發(fā)生發(fā)展的表達(dá)改變。本文結(jié)果顯示SOX5減弱miR-485-5p對(duì)Akt/GSK3β信號(hào)通路活化的抑制作用。表明miR-485-5p負(fù)調(diào)控SOX5抑制Akt/GSK3β信號(hào)通路活化參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-485-5p和SOX5的表達(dá)在HCC中呈負(fù)相關(guān)。miR-485-5p負(fù)調(diào)控SOX5抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力，作用機(jī)制可能是通過抑制Akt/GSK3β信號(hào)通路的活化。miR-485-5p和SOX5可能是抗HCC治療的分子靶標(biāo)。