李 文，王宗陵，李 倩，張孟之，龔華乾，吳雍真，周 艷，陳云志，柴藝匯，*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽(yáng) 550025)

2.興義市人民醫(yī)院(貴州 興義 562400)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)是以骨量低下以及骨微觀結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，從而易發(fā)生骨折系統(tǒng)性骨代謝紊亂疾病。患者常見(jiàn)癥狀為腰痛甚至全身疼痛，當(dāng)負(fù)重增加時(shí)更疼痛難當(dāng)、活動(dòng)受限。OP危害中老年人的身體健康和生活質(zhì)量，已成為嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題[1]。目前OP的治療以西藥為主，恰當(dāng)?shù)氖褂迷诙唐趦?nèi)有一定的療效，但長(zhǎng)期療效不理想，若使用不當(dāng)還存在一定毒副作用[2]。中醫(yī)學(xué)將OP歸屬于“骨痿”“骨枯”等病證，多與腎虛有關(guān)，而補(bǔ)腎類(lèi)中藥淫羊藿中的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，ICA)可通過(guò)多種途徑改善OP患者病理狀態(tài)，具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、抑制破骨細(xì)胞分化、減少骨吸收的陷窩數(shù)進(jìn)而改善骨組織結(jié)構(gòu)[3]。本實(shí)驗(yàn)擬以ICA干預(yù)治療維甲酸造模構(gòu)建OP大鼠模型，初步揭示ICA抗OP的作用機(jī)制[3]，為進(jìn)一步研究淫羊藿有效防治OP提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器48只8周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠，均購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量(190±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BX53型生物顯微鏡(奧林巴斯公司)，MK-3酶標(biāo)儀(Thermo公司)；5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，QuantStuDio 6)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)。

1.2藥物與試劑ICA(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：489-32 -7)；骨化三醇(青島正大海爾制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H200030491)；維甲酸(西安綠騰生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：LT2018030201)；大鼠骨鈣素骨谷氨酸蛋白OC ELISA試劑盒(武漢華美有限公司，批號(hào)：CSB-E05129r)；免多抗GAPDH(37KD)(杭州賢至生物有限001公司，AB-P-R)；兔多抗0C(11KD)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Bs-4917R)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與造模 將48只8周齡雌性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、維生素D組、ICA高劑量組、ICA中劑量組、ICA低劑量組，每組8只，并用苦味酸進(jìn)行色彩標(biāo)記，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱(chēng)重。對(duì)照組給予生理鹽水[8 mL/(kg·d)]灌胃，其余大鼠按照100 mg/(kg·d)，用藥體積8 mL/(kg·d)給予維甲酸灌服2周構(gòu)建OP模型，以宏觀疾病證候特征(大鼠行為學(xué)改變)和微觀生物學(xué)指標(biāo)作為模型評(píng)價(jià)的依據(jù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)給藥 造模結(jié)束后，空白對(duì)照組灌胃生理鹽水[8 mL/(kg·d)]，模型組灌胃維甲酸[8 mL/(kg·d)]，維生素D組給予灌胃骨化三醇30 ng/(kg·d)，ICA高劑量組給予灌胃ICA 120 mg/(kg·d)、ICA中劑量組給予灌胃ICA 60 mg/(kg·d)，ICA低劑量組給予灌胃ICA30 mg/(kg·d)，均為1次/d，連續(xù)干預(yù)治療42 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉無(wú)痛條件腹主動(dòng)脈取血，靜置于分離膠-促凝管中30 min后，4℃低溫離心，-80℃?zhèn)浯?。摘取右?cè)后腿股骨浸置于4%的多聚甲醛固定液內(nèi)4℃充分固定24 h以上。將左側(cè)后腿股骨組織冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢測(cè)指標(biāo)摘取的右側(cè)后腿股骨標(biāo)本經(jīng)HE染色，鏡檢觀察病理改變。 ELISA法檢測(cè)ICA大鼠血清骨鈣素(OC)含量的影，RT-PCR檢測(cè)OP大鼠左側(cè)后腿股骨OCmRNA的影響，嚴(yán)格按照Western blot操作步驟行大鼠左側(cè)后腿股骨OC蛋白表達(dá)的測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察灌服維甲酸2周后，大鼠飲食飲水明顯減少并出現(xiàn)便溏、體質(zhì)量下降，背毛光澤度較暗且凌亂倒刺、活動(dòng)度明顯下降、喜臥、弓背移動(dòng)；在進(jìn)行ICA干預(yù)后，大鼠的精神狀態(tài)改善，排泄物對(duì)比之前稍干燥、弓背緩解，飲食飲水量及自主活動(dòng)度明顯提高，體質(zhì)量增加。

2.2 HE染色病理觀察空白對(duì)照組可見(jiàn)骨小梁較多、體積較大、分布均勻，有豐富的血竇；維甲酸模型組骨小梁變少、變細(xì)、分布稀疏，骨小梁之間連接的游離端明顯增多，呈松散狀態(tài)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，骨細(xì)胞壞死，破骨細(xì)胞核染深、胞體大；與模型組比較，ICA高、中劑量組及維生素D陽(yáng)性藥對(duì)照組中，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，出現(xiàn)較為完整連續(xù)的骨組織，骨小梁變多、變粗，成骨細(xì)胞增多，骨髓腔變小且規(guī)則分布。與空白對(duì)照組比較，模型組骨小梁變薄、變細(xì)、結(jié)構(gòu)斷裂，破骨細(xì)胞明顯增多且功能活躍，骨髓腔內(nèi)面積增加，較為“空曠”。模型組大鼠右側(cè)后腿股骨皮質(zhì)骨面積有減少趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

2.3 ICA對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠血清OC的影響與空白對(duì)照組比較，模型組的OC水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，ICA各劑量組OC水平較低(P<0.05)；與模型組比較，維生素D組的OC水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 ELISA檢測(cè)藥物干預(yù)后大鼠血清OC含量

2.4 ICA對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠左側(cè)后腿股骨OC mRNA的影響與空白對(duì)照組相比，模型組骨骼OC mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組的骨骼OC mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 RT-qPCR檢測(cè)藥物干預(yù)后大鼠骨骼OC mRNA表達(dá)

2.5 ICA對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠左側(cè)后腿股骨OC蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比，模型組的骨骼OC蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組相比，ICA高、中劑量組和維生素D組的骨骼OC蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)表3，圖2。

表3 Western blot檢測(cè)干預(yù)后大鼠骨骼OC蛋白表達(dá)

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：維生素D組；D：ICA高劑量組；E：ICA中劑量組；F：ICA低劑量組。

3 討論

骨骼的不同部分由不同的形狀組成，但其內(nèi)部結(jié)構(gòu)大多具有相似層次結(jié)構(gòu)，主要包括I型膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)、非膠原蛋白及沉積于其中的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)[4]。骨骼的完整性由機(jī)體內(nèi)連續(xù)且重復(fù)的成骨和破骨兩個(gè)過(guò)程維持，此過(guò)程稱(chēng)為“骨重建”[5]。一般來(lái)說(shuō)，每年大約更換3%的骨皮質(zhì)、25%的骨小梁；成年期后，骨吸收率大于骨形成率并逐漸開(kāi)始出現(xiàn)負(fù)平衡，年齡越大骨量丟失情況將愈發(fā)嚴(yán)重[6]。OP是以骨組織損傷為特征的全身性骨代謝異常疾病。隨著OP發(fā)病的絕對(duì)人數(shù)明顯升高，尋求安全高效的藥物改善其癥狀成為亟待解決的問(wèn)題。OC是一種特定的非膠原基質(zhì)蛋白，由非增殖成骨細(xì)胞合成和分泌，是表現(xiàn)成骨細(xì)胞功能中較為敏感的指標(biāo)，在高轉(zhuǎn)化率的代謝性骨病中發(fā)揮重要作用[7]。目前，成熟OC主要沉積在骨組織和牙本質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)中，一小部分釋放到血液循環(huán)中[8]；抗骨吸收藥物可降低OC水平，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，維生素D缺乏的OP大鼠給予糾正OC等異常表達(dá)后可有效緩解OP的癥狀[9]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[10]在成骨細(xì)胞分化、基質(zhì)礦化以及骨吸收中，OC可直接反映骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，表明骨正在經(jīng)歷形成與吸收結(jié)合狀態(tài)。OP臨床表現(xiàn)與OC的變化密切相關(guān)[11]。臨床研究中，血清OC水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，但對(duì)于絕經(jīng)后婦女，由于骨轉(zhuǎn)換加速，OC升高到一個(gè)峰值；隨著步入老年，OC逐漸減少[12]。絕經(jīng)后女性O(shè)C水平顯著高于男性，卵巢的功能衰退伴隨雌激素的急劇下降，OC增加致使未形成足量骨基質(zhì)，影響鈣鹽沉著[13]。破骨細(xì)胞被刺激，數(shù)量增多，骨轉(zhuǎn)換率升高，骨吸收大于骨形成，使得細(xì)胞外的OC的含量升高。

中醫(yī)學(xué)《扁鵲心書(shū)》認(rèn)為：隨年歲增加腎氣虛、腎水竭，而發(fā)展為“骨縮病”，其表現(xiàn)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之OP類(lèi)似[14]，故根據(jù)OP的臨床表現(xiàn)將其歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。黃元御謂淫羊藿：“榮筋強(qiáng)骨，起痿壯陽(yáng)，滋益精血，溫補(bǔ)肝腎，治陽(yáng)痿不舉……起癱瘓，清風(fēng)明目，益志寧神。”由此可見(jiàn)，淫羊藿既補(bǔ)陽(yáng)氣又益陰精，藥效之間相輔相成，恰中骨質(zhì)疏松“腎精不足”的病機(jī)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也汲取了古代醫(yī)學(xué)的治療經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)展淫羊藿相關(guān)臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，淫羊霍除了發(fā)揮雌激素樣作用，還可促進(jìn)腸鈣及尿鈣的重吸收，進(jìn)而防止骨量丟失[15]；廣泛應(yīng)用于骨骼類(lèi)疾病的仙靈骨葆膠囊，其主要成分為淫羊藿，能顯著改善OP患者骨密度狀況，并能顯著升高血清OC水平[16]。淫羊藿中主要活性成分ICA可提高血清OC含量、維持骨的礦化率、抑制軟骨的礦化[17]。由此可見(jiàn)，補(bǔ)腎中藥淫羊藿具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，無(wú)論辯證與否，均可作為治療OP的治療藥物之一。

本組結(jié)果表明，相對(duì)于模型組，ICA高劑量組OC水平較低，維生素D組的OC水平顯著降低；檢測(cè)大鼠骨RT-qPCR結(jié)果提示，與模型組比較，各藥物干預(yù)組的骨骼OC mRNA表達(dá)均顯著下降；大鼠左側(cè)后腿股骨Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，ICA高、中劑量組和維生素D組的骨骼OC蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。綜上，ICA可通過(guò)調(diào)節(jié)維甲酸所致OP模型大鼠骨骼中OC mRNA和蛋白水平，從而達(dá)到防治OP的目的，為進(jìn)一步研究ICA治療OP的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中醫(yī)藥防治OP提供研究思路。