許 歡，張永萍,2*，段 麗

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽 550025)

2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心(貴州 貴陽 550025)

3.國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司(貴州 貴陽 550025)

苗醫(yī)理論認(rèn)為人體中的氣是人體生靈能的主要表現(xiàn)形式，氣的不足也是生靈能減退的表現(xiàn)，必然會導(dǎo)致體能和各相應(yīng)架組功能的下降。氣弱的總體表現(xiàn)主要為疲乏無力、心慌氣短、易累易疲倦、聲音低微、脈弱神衰等。血中含有各種供生物質(zhì)的精微，是人體內(nèi)最重要的組分。血液的不足導(dǎo)致供生物質(zhì)的減少，也必然導(dǎo)致身體的衰弱和體能的不足[1]。苗醫(yī)理論認(rèn)為“積勞成疾”，過度勞累，這種“亂”會導(dǎo)致內(nèi)臟、筋骨等受損，進(jìn)而導(dǎo)致身架受損；冷病因為氣不足，表現(xiàn)為患病后體質(zhì)衰弱，內(nèi)臟功能不足或虧損，或架構(gòu)失常。不同內(nèi)臟的虧損或架構(gòu)失常，其表現(xiàn)癥狀也不同。如血弱表現(xiàn)為面唇蒼白無血色、全身軟弱、易疲勞等；氣弱表現(xiàn)為神疲乏力、心慌氣短、聲音低微等。苗醫(yī)治療冷病采用補體法，包括補氣法、補血法等。苗藥理論中補氣藥是指以補充人體生靈能，提高人體機(jī)能活性為主要功效的藥物。血人參是豆科蝶形花亞科植物茸毛木藍(lán)(IndigoferastaclrvoidesLindl.)的根，是貴州苗族常用藥。血人參植物主要含有揮發(fā)油、黃烷醇、甾醇體類等活性化學(xué)成分[2-4]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、抑菌、抗病毒等作用[5-8]。血人參性溫，味微苦澀，有補氣攝血、滋陰補腎之功效，主治崩漏、跌打、風(fēng)濕、肝硬化、痢疾及疳積等[9]。芪膠升白膠囊是貴州苗藥制劑之一，由血人參、大棗、阿膠、淫羊藿等中藥組成，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒等作用，用于白血病的治療中[10]。在課題組前期的研究基礎(chǔ)上[6,8]，通過建立“氣弱血弱體弱”型冷病動物模型探尋血人參乙酸乙酯(YSYZ)部位及芪膠升白膠囊對機(jī)體能量代謝、血液系統(tǒng)、免疫機(jī)能等方面的影響，探索苗醫(yī)藥氣弱體虛及冷病熱治理論的實驗研究方法，為苗藥血人參及芪膠升白膠囊的開發(fā)應(yīng)用奠定一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級KM小鼠，雄性，體質(zhì)量(18～22)g，購于重慶騰鑫生物科技有限公司(許可證號：SCXK(軍)2012-0011)。

1.2藥物與試劑血人參(貴州德昌祥藥業(yè)有限公司，批號：160211)；血人參YSYZ部位(實驗室自制)；芪膠升白膠囊(貴州德昌祥藥業(yè)有限公司，批號：25270051)；小鼠ATP酶(ATPase)ELISA試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號：20171115)；小鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)ELISA試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號：20171111)；小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)ELISA試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號：20171111)；番瀉葉(購自貴陽一品藥業(yè)，生產(chǎn)批號：20160311)。

1.3主要儀器ZZ-6小鼠自主活動測試儀(成都泰盟科技有限公司)；AUY200電子分析天平(日本島津)；ALC-2013電子秤(北京愛科勒有限公司)、計時器(深圳昂升科技有限公司)；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國GE公司)；移液器(德國 Eppendorf 公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.4方法

1.4.1 藥品的配制 芪膠升白溶液的配制：取芪膠升白膠囊內(nèi)容物，天平稱重后，用0.25%羧甲基纖維素鈉配成2.00、1.00、0.50 g/mL溶液，4℃保存?zhèn)溆茫谎藚SYZ部位溶液的配制：取血人參YSYZ部位，天平稱重后，加蒸餾水配制成0.33、0.17、0.08 g/mL溶液，4℃保存?zhèn)溆?；八珍顆粒溶液的配制：取八珍顆粒，天平稱重后，加蒸餾水配制成1.17 g/mL溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 動物造模及藥物干預(yù) 雄性KM小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、八珍顆粒陽性對照組(劑量1.17 g/kg，以下簡稱陽性組)、YSYZ部位高中低劑量組(劑量分別為：0.33、0.17、0.08 g/kg，以下簡稱YSYZ組)、芪膠升白膠囊高中低劑量組(劑量分別為：2.00、1.00、0.50 g/kg，以下簡稱芪膠組)，每組10只。每天早上8點灌胃40%番瀉葉水浸液，10點進(jìn)行竭力游泳(水溫23～25℃，力竭指標(biāo)為動物失調(diào)；慌張，鼻部在水面上下浮動，頭浸入水下10 s不能上浮為力竭標(biāo)準(zhǔn))，下午2點給予相應(yīng)藥物，給藥容積0.1 mL/10 g，尾部放血0.2 g(小鼠用75%酒精棉球擦拭尾部，使血管擴(kuò)張充血，剪去鼠尾尖端1～2 mm左右，進(jìn)行放血，放血后，用棉球壓迫止血)，隔2 d放1次，如此重復(fù)4周。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1 小鼠一般狀態(tài)觀察及游泳時間的測定 實驗過程中注意觀察小鼠身形、活動、對外界刺激反應(yīng)情況、皮毛、飲食、二便等是否正常。每周稱量體質(zhì)量，實驗3周后，進(jìn)行疲勞游泳時間的測定，第4周實驗結(jié)束后，禁食不禁水12 h，眼球取血于抗凝管中，4 000 r/min，10 min分離血漿于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 小鼠免疫器官指數(shù)的計算 取小鼠脾、胸腺，去除周圍脂肪組織，稱重，計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.5.3 ELISA法檢測小鼠血漿ATP、cAMP、cGMP水平 將血漿及試劑平衡至室溫，試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1對小鼠一般狀態(tài)的影響給藥前各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，小鼠身形勻稱，活動自如，對外界刺激反應(yīng)正常，皮毛濃密、色乳白有光澤，飲食、二便均正常。造模后各組小鼠皮毛稀疏且暗淡無光澤，飲食減少，鼠尾冰冷。藥物治療后，陽性藥物組、YSYZ高劑量組、芪膠高劑量組小鼠身形勻稱，活動自如，皮毛濃密、色乳白有光澤。

2.2對小鼠體質(zhì)量和游泳時間的影響實驗前各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，實驗后，正常組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增加。實驗1周時，模型組、陽性組、YSYZ高劑量組、芪膠高、低劑量小鼠體質(zhì)量較正常組明顯減輕(P<0.05或P<0.01)；實驗2周時，陽性組、芪膠各劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯增加(P<0.05或P<0.01)；實驗3周時，芪膠中低劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯增加(P<0.05)；實驗4周時，與正常組比較，各治療組小鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組小鼠竭力游泳時間較正常組小鼠顯著減少(P<0.01)，各組小鼠竭力游泳時間均高于模型組，實驗3周時，與模型組比較，陽性組、YSYZ高劑量組、芪膠低劑量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；實驗4周時，與模型組比較，陽性組、YSYZ高劑量組、芪膠中低劑量組小鼠竭力游泳時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表1、2。

2.3對小鼠免疫器官的影響各實驗組脾指數(shù)明顯高于正常組，除YSYZ中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；芪膠升白膠囊高劑量組脾指數(shù)高于模型組，其余各組脾指數(shù)均小于模型組，其中YSYZ中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；各組小鼠胸腺指數(shù)變化不顯著，見表3。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化的比較

表2 各組小鼠竭力游泳時間

表3 各組小鼠胸腺、脾指數(shù)的比較

2.4對小鼠ATP、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值影響與正常組比較，各實驗組ATP酶活性均增強(qiáng)，除YSYZ高劑量組及芪膠高、中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，YSYZ高劑量組、芪膠高中劑量組ATP酶含量明顯減少(P<0.01)；與陽性藥物組比較，正常組、YSYZ高劑量組、芪膠高中劑量組ATP酶含量明顯減少(P<0. 01)。與正常組比較，各實驗組cAMP酶含量均增加，模型組、陽性藥物組、YSYZ低劑量組、芪膠低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，芪膠中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各實驗組cAMP酶含量均減少，除陽性藥物組和芪膠低劑量組，其余各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與陽性藥物組比較，正常組、YSYZ部位高中劑量組、芪膠高中劑量組cAMP酶含量明顯減少(P<0.01)。與正常組比較，各實驗組cGMP酶含量均增加，模型組、陽性藥物組、YSYZ各劑量組、芪膠中、低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，芪膠劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，YSYZ高劑量組、芪膠高中劑量組含量明燭降低(P<0.05或P<0.01)；與陽性藥物組比較，YSYZ高劑量組、芪膠中低劑量組含量明顯降低(P<0.05)，芪膠升白膠囊高劑量含量明顯降低(P<0.01)。與正常組比較，YSYZ中劑量和芪膠低劑量組cAMP/cGMP比值明顯減小(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠ATP、cAMP、cGMP及cAMP/cGMP比較

3 討論

苗醫(yī)理論認(rèn)為人體中的氣(主要指惠氣)是人體生靈能的主要表現(xiàn)形式，氣的不足也是生靈能減退的表現(xiàn)，必然會導(dǎo)致體能和各相應(yīng)架組功能的下降。氣弱的總體表現(xiàn)主要為疲乏無力、心慌氣短、易累易疲倦、聲音低微、脈弱神衰等；血中含有各種供生物質(zhì)的精微，是人體內(nèi)最重要的組分。血液的不足導(dǎo)致供生物質(zhì)的減少，也必然導(dǎo)致身體的衰弱和體能的不足；苗醫(yī)理論認(rèn)為“積勞成疾”，過度勞累，這種“亂”會導(dǎo)致內(nèi)臟、筋骨等受損，進(jìn)而導(dǎo)致身架受損。中醫(yī)學(xué)中的“饑則損氣”，長期慢性饑餓可導(dǎo)致以脾胃氣虛為主的全身性氣虛表現(xiàn)?！皠趧t耗氣”，強(qiáng)迫小鼠長時間大運動量運動，使之過度疲勞可耗氣傷精，勞累之后更加納呆食差，氣虛則血虛。故采用“放血”、“疲勞”等方法建立“氣弱血弱體弱”冷病動物模型。本組結(jié)果表明。治療后各組小鼠竭力游泳時間均高于模型組，各組小鼠身形、活動等得到一定改善，其中YSYZ高劑量組、芪膠高劑量組小鼠身形勻稱，活動自如，皮毛濃密、色乳白有光澤，表明血人參極其制劑對“氣弱血弱體弱”冷病模型小鼠具有一定的治療作用。

ATP、cAMP、cGMP是細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在細(xì)胞代謝及多種生理效應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。血漿中的cAMP、cGMP來源于組織細(xì)胞，是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，是激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物效應(yīng)的中間樞紐，保證機(jī)體正常的生理功能，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。正常情況下，cAMP、cGMP的水平要保持動態(tài)平衡。一旦平衡失調(diào)，細(xì)胞功能也將發(fā)生明顯變化[11]。 cAMP、cGMP這種拮抗性調(diào)節(jié)作用與人體的陰陽相關(guān)。學(xué)者通過多年研究認(rèn)為：凡中醫(yī)辨證陽虛者，cAMP/cGMP比值明顯降低；而辨證為陰虛者則表現(xiàn)為 cAMP含量升高，cAMP/cGMP比值無明顯降低。因此臨床上測定cAMP和cGMP的含量及其比值，可以成為判斷陰虛、陽虛的一個客觀指標(biāo)，同時也可作為其病情演變的指標(biāo)之一[12]。本實驗中YSYZ高劑量組、芪膠高中劑量組小鼠血漿ATP酶含量較模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；各實驗組小鼠血漿cAMP酶含量較模型組均減少，除陽性藥物組和芪膠低劑量組，其余各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；YSYZ高劑量組、芪膠升白膠囊高中劑量組小鼠血漿cGMP含量較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，說明血人參及其制劑(芪膠升白膠囊)對“氣弱血弱體弱”冷病模型小鼠的體質(zhì)量、臟器指數(shù)、血漿ATP、cAMP、cGMP值具有一定的調(diào)節(jié)作用，尤其是YSYZ部位高劑量組、芪膠高劑量能調(diào)節(jié)小鼠偏離正常值的ATP、cAMP、cGMP值。

綜上所述，苗藥血人參及其制劑對“氣弱血弱體弱”冷病模型小鼠具有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能與影響小鼠的體質(zhì)量、免疫器官及調(diào)節(jié)小鼠偏離正常值的ATP、cAMP、cGMP水平表達(dá)有關(guān)。