莊文杰 叢寧 韓朝

通過各種方法改善聽力的研究主要在藥物和噪聲聾的模型上進行。藥物性聾的模型可以通過注射新霉素、慶大霉素、卡那霉素或使用前述藥物的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用速尿或利尿酸[1-5]，也可以單純應(yīng)用順鉑造成內(nèi)毛細(xì)胞為主的丟失[6]。噪聲聾的模型主要使用穩(wěn)態(tài)噪聲或脈沖噪聲。這些都是比較成熟的模型。但是這些模型除應(yīng)用順鉑外不僅僅是造成毛細(xì)胞的損害，還對基底膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，從而使毛細(xì)胞再生和聽覺恢復(fù)的研究變得復(fù)雜困難，盡管這與臨床比較接近，但是同時將問題復(fù)雜困難化。本實驗發(fā)現(xiàn)通過耳蝸側(cè)壁打孔經(jīng)中階入路灌注注射用水或病毒液可以引起以外毛細(xì)胞為主的損失，同時這種損害的程度與灌注液體的成分似乎沒有直接的影響，從而獲得了一個較為單純的以外毛細(xì)胞損傷為主的耳聾模型。這個模型不僅具有僅造成基底膜單一細(xì)胞損害的優(yōu)點外，還為中階內(nèi)淋巴藥物灌注建立了臨時通路。

資料與方法

1 材料

250～350g 健康花豚鼠12 只（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)科大學(xué)動物科學(xué)部提供），雌雄不拘，耳郭反射正常，無耳疾。聽覺誘發(fā)電位儀器使用BIOLOGIC 儀器。微量泵（53110V Single Syringe Pump, infusion, 220v,美國STOELTING 公司）。玻璃微電極。Fast Green Dye 快綠生物染料（sigma 公司）。共聚焦顯微鏡。Palloidin（sigma 公司）。Carl Zeiss 顯微鏡和顯微耳科手術(shù)器械，聚亞酰胺微管內(nèi)徑0.08mm，外徑0.1mm（Code 039-I 購自美國 MicroLumen 公司），Ad-EGFP 病毒總感染滴度（PFU）為 1.0×1011（Ad0112d，北京本元正陽公司），Leica DMR 顯微鏡（熒光和自然光），leica DFC300 FX 圖像采集系統(tǒng)，leica Qwin V3 圖像處理系統(tǒng)（Leica Microsysems, 瑞士）。

2 造模方法

氯胺酮（肌注，40mg/kg，臨床劑型）2%利多卡因（皮下注射，0.5ml/次，臨床劑型）和甲苯噻嗪(肌注，10mg/kg，南京法姆化工廠)。麻醉成功后仰臥位，伸頸，使用脫毛劑（8%硫化鈉）脫毛。0.5%碘伏消毒皮膚。自左側(cè)下頜下緣中點，平行于頸正中線向下剪開毛皮長約1.5cm。皮下稍加分離后置入撐開器，提起頸闊肌剪開一小口然后避開血管擴大切口，此時應(yīng)該可以看到白亮的咬肌鍵膜，沿著咬肌內(nèi)側(cè)表面向深處分離，將腺體牽向中線（灰白色泡膜狀），下頜下腺及頸外靜脈在下方也牽向中線，下方可以看到莖突及前方走向的二腹肌后腹及鍵膜，在咬肌內(nèi)側(cè)二腹肌深處可以探到一個骨性平面就是骨性聽泡了，將肌肉和迷走神經(jīng)牽向中線就可以看到骨面。分離骨膜上撐開器。用血管鉗在骨面最突起的后內(nèi)方夾開少許骨質(zhì)，去除后，撕掉內(nèi)面的骨膜就進入聽泡，可以看到內(nèi)側(cè)的耳蝸和外側(cè)的鼓膜。在倒數(shù)第二圈（基本上覆蓋40%～70%的區(qū)域頻率在1～8K 之間的基底膜區(qū)）的中部色素帶偏下打孔（使用自制尖端0.2mm 的三棱針）。導(dǎo)入聚亞酰胺微管，深度在0.1～0.2mm 之間，另一端連接微量注射泵（速率為0.5μl/min），藥物容量為5μl（含1μl 0.25%快綠生物染料），使用快綠生物染料作為指示劑，確定是否位于中介內(nèi)，病毒組使用攜帶egfp 基因的腺病毒和快綠生物染料混合液。注射用水組使用商品化的注射用水和快綠生物色素混合液。注射完畢，用小塊頸闊肌封閉骨孔，用牙科磷酸鋅水門汀（上海齒科材料廠）封閉聽泡骨性開口。分層縫合切口。

3 標(biāo)本處理與Phalloidin 染色步驟

ABR 測試結(jié)束后，豚鼠使用麻藥麻醉后，斷頭取顳骨剝離出耳蝸，于頂部打孔，開放兩窗，進行4%多聚甲醛灌注2 次，浸于4%多聚甲醛中過夜，去除蝸殼骨質(zhì)，充分暴露依附于蝸軸的螺旋狀基底膜，從頂圈開始用細(xì)針將基底膜完整剝離下來，放于瓶蓋中 PBS 沖洗 3 次 5min，0.3%Triton-100 通透40min，PBS沖洗 3 次，5min，phalloidin (1:600) 濕盒37℃，1h，PBS 沖洗 3 次 5min，0.3%Triton-100 通透20min，Dapi 常溫孵育 20min，PBS 沖洗 3 次，將基底膜小心的移入滴有10%甘油的載玻片上，使用顯微刀片將基底膜分段切開，蓋蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照[7]。

4 ABR 測試方法

ABR 測試在手術(shù)結(jié)束24h 后進行，麻醉成功后，豚鼠處于腹臥位，參考電極接于測試耳乳突皮下，動作電極接于顱頂雙耳中間，接地電極接于對側(cè)耳乳突部皮下。由于bio-logic 的電極之間可以自動轉(zhuǎn)化，因此將common 電極接于顱頂，right 電極接于右耳，left 電極接于左耳，電阻小于5 歐姆，極間電阻小于2 歐姆。Click 進行測試。從20dB SPL 開始，一直到出現(xiàn)明顯的5 個波形，然后下降5dB 出現(xiàn)2～4 之間的任何一個于5 個波潛伏期一致波形，視為聽覺閾值。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計學(xué)軟件，兩組t 檢驗。

結(jié)果

1 試驗豚鼠中共有12 只成功的進行了5ul 內(nèi)淋巴灌注，快綠生物染料顯示清晰（圖1），其中灌注方向朝向頂圈的有6 只，朝向底圈的有6 只。在灌注的方向上基底膜的毛細(xì)胞特別是外毛細(xì)胞受損嚴(yán)重，而灌注方向相反的基底膜受損較輕。灌注方向朝向底圈，毛細(xì)胞損失從底圈上部開始，圍繞穿刺部位趨重（見圖 2a，b，c，d）。灌注方向朝向頂圈，倒數(shù)第三圈上部至頂圈毛細(xì)胞正常，倒數(shù)第三圈中部以下外毛細(xì)胞幾乎完全消失（見圖 3a，b，c，d），而使用Dapi 染核顯示支持細(xì)胞的胞核數(shù)量變化不明顯，細(xì)胞核顯示飽滿，均質(zhì)（圖4）。腺病毒灌注在快綠染料顯示注入中階內(nèi)淋巴系統(tǒng)時，腺病毒攜帶的綠色熒光蛋白基因表達顯示注入了中階內(nèi)淋巴里（圖5）。

圖1 顯示聚亞酰胺微管導(dǎo)入豚鼠耳蝸倒數(shù)第二圈的中階中快綠生物染料示導(dǎo)入正確20 倍

圖2 腺病毒灌注方向朝向頂圈。a 底圈的外毛細(xì)胞沒有任何丟失現(xiàn)象；b 倒數(shù)第二圈的外毛細(xì)胞損失較輕；c 倒數(shù)第三圈外毛細(xì)胞損失嚴(yán)重僅存零星幾個外毛細(xì)胞；d 頂圈外毛細(xì)胞損害嚴(yán)重，殘留外毛細(xì)胞較倒數(shù)第三圈略多。

圖3 腺病毒灌注方向朝向底圈。a 底圈外毛細(xì)胞全部丟失；b 倒數(shù)第二圈外毛細(xì)胞全部丟失；c 倒數(shù)第三圈僅存幾個外毛細(xì)胞；d 頂圈外毛細(xì)胞受損輕可見零星幾個外毛細(xì)胞丟失。

圖4 圖3b 相同位置Dapi 核染料顯示除了外毛細(xì)胞胞核幾乎全部消失外，包括內(nèi)毛細(xì)胞，內(nèi)外柱細(xì)胞等支持細(xì)胞位置的胞核仍然存在

圖5 倒數(shù)第二圈腺病毒灌注后phalloidin 染色共聚焦顯微鏡顯示綠色熒光蛋白（egfp）在基底膜的部分支柱細(xì)胞和支持細(xì)胞有表達

2 ABR 測試結(jié)果

觀察到當(dāng)灌注方向朝向底圈時，通過CLICK 測試的豚鼠聽閾提高的閾值(92.5±8.22dB SPL)要高于灌注方向朝向頂圈的豚鼠聽閾閾值（63.3±6.83dB SPL），P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表 1）。

表1 不同朝向注射后ABR 測試結(jié)果

討論

本模型手術(shù)的操作國內(nèi)外已經(jīng)有報道[8，9]，文獻中只是作為一種內(nèi)淋巴給藥的方式并沒有意識到這種方式本身的造模價值。本研究中毛細(xì)胞損害的分布與文獻報道的有相似之處[8]。但是本實驗同時使用了兩種方向，進一步驗證了灌注方向是決定毛細(xì)胞損害分布的關(guān)鍵。同時使用click 進行ABR 的測試發(fā)現(xiàn)灌注方向的不同，測試的閾值也不同，兩者存在相關(guān)性。當(dāng)朝底圈方向灌注引起底圈毛細(xì)胞受損嚴(yán)重時，click 測試的閾值提高明顯。當(dāng)朝頂圈方向灌注引起底圈毛細(xì)胞受損較輕時，click 測試的閾值提高較前者小。這直接證實了文獻中報道的豚鼠耳蝸第二圈中間向下的基底膜對應(yīng)于2kHz 以上的頻率范圍[10]，由于 CLICK 的主頻在 2～4kHz，因此如果注射方向朝向底圈，引起第二圈中間以下的毛細(xì)胞大量損失，click 閾值提高明顯。說明該模型同時可以使用click 測試來判斷灌注的方向，從而明確毛細(xì)胞損害的分布。對實驗的評估有重要意義。

該模型的建立可以獲得只有毛細(xì)胞缺失，而支持細(xì)胞的數(shù)量通過其胞核來判斷幾乎沒有損失的耳聾模型，這種模型有利于作為將支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的基因操控的平臺，有利于復(fù)雜問題的分解解決，目前盡管基因可以將支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞，但是目前無論是藥物性聾，還是噪聲性聾都不僅僅是毛細(xì)胞損害，同時損害的還有支持細(xì)胞以及基底膜的結(jié)構(gòu)和后期的螺旋神經(jīng)元損害，同時不能同步進行治療藥物的灌注，在這種基礎(chǔ)上直接完成聽力改善的研究，困難是非常大的。而本實驗?zāi)Ｐ颓∏∈瞧鸬搅艘粋€承上啟下的作用，等于將復(fù)雜問題簡單分步化。同時由于本實驗在造模的過程中同時建立了臨時的內(nèi)淋巴給藥的通路可以將所需的藥物或基因載體一次性導(dǎo)入，非常方便，而且由于作者研究證實無論使用的是注射用水，還是腺病毒保存液，兩者對造成的聽力損害沒有差別[11]，更給操作的可行性及后期的臨床使用開辟了道路。有文獻使用人造內(nèi)淋巴液做內(nèi)淋巴間隙灌注與腺病毒液進行比較證實兩者對聽力的影響沒有差別[8]。而作者考慮到以后臨床上注射用水使用方便，因此采用了注射用水來與腺病毒液進行比較，試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示兩者對聽力的影響同樣沒有顯著差別，對毛細(xì)胞的損害程度從形態(tài)上也未見明顯差別[11]。兩者的結(jié)果也間接證實了引起毛細(xì)胞損害的主要原因不是內(nèi)淋巴液成分的變化。

但是本模型中毛細(xì)胞喪失的機理并不清楚，前面已經(jīng)論述了內(nèi)淋巴液成分變化引起的可能性很小，而結(jié)合本實驗方向性決定了外毛細(xì)胞死亡的分布，更加排除了成分變化是主要原因的可能，因為如果是內(nèi)淋巴成分變化引起的，整個內(nèi)淋巴系統(tǒng)的成分都改變了，毛細(xì)胞應(yīng)該都受損，可能因為耐受性不同而有所差別。受損的毛細(xì)胞主要分布在灌注的方向上，似乎提示是壓力的變化在其中發(fā)揮主要的作用，因為灌注的方向存在壓力的梯度，剛好與毛細(xì)胞損害的分布相一致。如果真是這樣的話，該模型可能同時模擬了梅尼埃病的發(fā)病機制。梅尼埃病的發(fā)病機制目前認(rèn)為是膜迷路積水，即膜迷路壓力增加造成的。梅尼埃病每次發(fā)作都會引起聽力的下降，可解釋為每次壓力的提高造成了部分毛細(xì)胞的損失，由于壓力是一過性的相對輕微，因此引起的毛細(xì)胞損害少，而且由于壓力均衡毛細(xì)胞損害的范圍也同時涉及高頻和低頻區(qū)。但是最終該模型是否真的能夠模擬梅尼埃病的發(fā)病機制，有待進一步試驗證實。該模型由于對豚鼠來說只是局部損傷不同于噪音和藥物的影響，因此對于耳鳴的研究來說也是一個很好的單純外周去出入模型。因為噪音和藥物不可避免的會引起動物情緒或其他方面的影響[12]。另外，本模型之所以采用豚鼠，是因為豚鼠的耳蝸相比小鼠、大鼠更大，圈數(shù)更多，結(jié)果相對更好。對于這種高度精細(xì)的操作，成功率更高一些。當(dāng)然本模型的技術(shù)難度還是很高，需要良好的解剖知識，高超的手術(shù)操作技巧。